العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

الهدف من هذا الإجراء هو عزل واستزراع الخلايا العصبية الأولية من الدماغ المتوسط البطني للقوارض بكفاءة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الدماغ المتوسط لأجنة القوارض، ثم تلي ذلك خطوة عزل الدماغ المتوسط البطني بعناية.

بعد ذلك، يجب تفكيك النسيج العصبي للحصول على معلق من الخلايا المفردة. وتتمثل الخطوة النهائية في زرع العصبونات الأولية في حجم صغير على شرائح غطاء قبل نقل الخلايا الملتصقة لاحقاً إلى طبق مكون من 24 بئراً. وفي النهاية، يُستخدم الأجسام المضادة والمجهر الفلوري المناعي لتحديد العصبونات الدوبامينية داخل المزرعة.

تشارك العصبونات الدوبامينية في الدماغ المتوسط في عدة وظائف، بما في ذلك التحكم في الحركة والعاطفة في الإدراك وإفراز المكافأة في الدماغ. كما أنها مرتبطة بحالات عصبية ونفسية عصبية، بما في ذلك مرض باركنسون، والإدمان، والفصام. طريقة إصلاح الدماغ المتوسط البطني.

يمكن استخدام المزارع العصبونية لدراسة الفسيولوجيا والخصائص الخلوية للعصبونات الدوبامينية، وكذلك لفهم سبب تنكسها أثناء سياق اضطرابات مثل مرض باركنسون. أولاً، قم بتجهيز الشرائح الغطائية.

اغلِها في ethanol بتركيز 70% لمدة 30 دقيقة على الأقل لإزالة أي آثار للدهون. ثم قم بمعالجة شرائح التغطية بالـ autoclave. انقل شرائح التغطية إلى أطباق ذات 24 بئراً وأضف نصف مليليتر من polyol all athene إلى كل بئر.

اترك الأطباق لتحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يرجى ملاحظة أن مدة صلاحية محلول polyol أو Athene العامل هي شهر واحد. بعد ذلك، اغسل شرائح التغطية ثلاث مرات باستخدام 0.5 mL من الماء في كل غسلة.

بدون إجراء عمليات الغسل الثلاث، لن تبقى الخلايا المستزرعة على قيد الحياة لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، قم بتحضير محلول اللامينين. تأكد أولاً من إذابته ببطء على الثلج.

بعد ذلك، قم بإذابة اللامينين في وسط D-M-E-M-F 12 البارد، واستخدمه على الفور. الآن، أضف 0.5 mL من محلول اللامينين العامل المُحضّر حديثاً إلى كل بئر، واترك الأطباق لتحضن طوال الليل عند 37 °C. وأخيراً، عند تحضير الماصة الزجاجية، أقوم بصقل أطرافها لتصل إلى نصف حجمها المعتاد.

قم بإجراء شق في البطن للكشف عن أكياس الرحم، واستخدم الملقط لقطع وتحرير الرحم. انقل الرحم إلى محلول HBSS مبرد بالثلج في طبق قطرُه 100 مليمتر، وابدأ في إزالة الأجنة باستخدام الملقط. ثم انقل الأجنة المعزولة إلى طبق جديد يحتوي على محلول HBSS مبرد.

الآن، وباستخدام مجهر التشريح، استعد للوصول إلى هذا الموقع من منتصف الدماغ البطني تحت تكبير 10 x. قم بتشريح الـ meas والقوس الرأسية عن طريق قطع الدماغ عند البرزخ ومنطقة الحدود الـ meas والـ cephalic di cephalic باستخدام مقص حيوي أو ملقط. بعد إخراج منتصف الدماغ بالكامل، قم بإجراء قطع في الجزء الظهري الإنسي من منتصف الدماغ.

استخدم الملقط لإزالة السحايا. هذه الخطوة حاسمة لنجاح استنبات الخلايا العصبية، حيث إن الخلايا غير العصبية ستموت في ظل ظروف الاستنبات وسترسل إشارات سلبية إلى الخلايا العصبية المجاورة.

الآن، قم ببسط نسيج الدماغ المتوسط ليتخذ شكل الفراشة. اقطع حوالي نصف كل جناح باستخدام شفرة معقمة مع الإبقاء على الجزء البطني من الدماغ المتوسط. انقل الجزء البطني من الدماغ المتوسط إلى محلول HBSS مبرد بالثلج في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر.

بعد ذلك، باشر في عملية تشريح الجنين التالي وكرر ذلك مع أكبر عدد ممكن من الأجنة خلال ساعة واحدة. فالأجنة التي تُحفظ على الثلج لأكثر من ساعة تكون حيوية خلاياها ضعيفة. ولضمان الحيوية العالية للعصبونات الدوبامينية، يجب ألا يتجاوز الوقت المنقضي من التشريح وحتى الزراعة ساعة واحدة.

بالإضافة إلى ذلك، يعد إزالة السحايا أمراً حاسماً لبقاء الخلايا العصبية تحت الغطاء. قم بإزالة HBSS من مجموعة الدماغ المتوسط البطني. ثم أضف مليلتراً واحداً من 0.05%tripsin A DTA الدافئ، وهي كمية كافية من المحلول لـ 12 قطعة من الأنسجة.

قم بتحضين النسيج عند 37 °C لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. داخل خزانة السلامة الحيوية، استبدل tripsin A DTA بـ 1 mL من وسط التعطيل (deactivation medium). قم بالتحريك بلطف للمزج، ثم تخلص من وسط التعطيل، مع ترك كمية كافية من الوسط لضمان عدم التخلص من الخلايا المنفصلة.

بعد ذلك، اغسل الأنسجة بالوسط الكامل مرتين مع الحرص على عدم فقدان الخلايا. الآن أضف 1 mL من الوسط الكامل. ثم قم بتفتيت النسيج باستخدام ماصة مصقولة بالنار دون تكوين فقاعات حتى يتم الحصول على معلق من الخلايا المفردة.

يجب أن تكون ثمانية إلى 10 ممرات كافية. بعد هذه المدة، قم بطرد الخلايا مركزياً عند 400 Gs لمدة خمس دقائق. أزل الوسط وقم بإعادة تعليق الخلايا في واحد ملليلتر من الوسط الكامل.

قم بسحب الخلايا بالماصة حتى أربع مرات لتحقيق تعليق متجانس. ابدأ بعدّ الخلايا وتقييم حالتها الصحية في التعليق، وذلك باستخدام طريقة استبعاد صبغة التريبان الأزرق (trypan blue) مع مقياس كرات الدم (hemocytometer).

قم الآن بتعديل تركيز معلق الخلايا ليصل إلى 1500 خلية لكل µL. بعد ذلك، انقل أغطية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة إلى أطباق بقطر 100 مليمتر. ضع شرائح التغطية المجهزة على الأغطية باستخدام الملقط.

لا تغسل شرائح التغطية وحاول ألا تتركها تجف. ضع 100 µL من المعلق على كل شريحة تغطية. توفر هذه الطريقة غير التقليدية نوعاً ما حيوية للمزرعة بنسبة 90% وهي خطوة حاسمة لضمان النجاح.

ثم أغلق طبق بيتري وانقله إلى الحاضنة لمدة ساعة، وبعد فترة التحضين، انقل الرقائق الغطائية مع الوسط بعناية إلى أطباق ذات 24 بئراً تحتوي كل بئر منها على 400 µL من الوسط الكامل المسخن إلى 37 °C، ثم حضّن الخلايا طوال الليل. وتعد الساعات القليلة الأولى هي الأكثر حرجاً لبقاء الخلايا على قيد الحياة خلال 24 ساعة. أضف بلطف نصف mL من الوسط الكامل إلى كل بئر.

كل أسبوعين. يتم تغيير نصف الوسط الغذائي. إذا تحول لون المزرعة إلى الأصفر، يمكن إجراء عملية تغيير نصف الوسط في وقت أقرب، ولكن يجب أن يظل التغيير غير متكرر.

سوف تبقى العصبونات الدوبامينية على قيد الحياة لأكثر من ستة أسابيع تحت هذه الظروف. وبعد أسبوعين من الزرع، يُظهر الكيمياء النسيجية المناعية ضد التيروزين، والهيدروكسيليز، والعلامات العصبونية أن 1% من الخلايا هي عصبونات دوبامينية. وتظهر الإسقاطات العصبونية في غضون ساعتين من عملية الزرع.

بحلول نهاية اليوم الأول من الزراعة، تصبح المحاور العصبية والزوائد الشجرية قابلة للتمييز. وفي نهاية المطاف، تبقى الخلايا العصبية على قيد الحياة لأكثر من ستة أسابيع وتظهر نمواً واسع النطاق بعد اتباع هذا الإجراء. ويمكن إجراء طرق أخرى مثل ترنسدكشن الفيروسات، أو التألق المناعي، أو الفيزيولوجيا الكهربائية من أجل الإجابة على الأسئلة الآلية في الخلايا العصبية الدوبامينية.