والطريقة المبسطة للفائقة منخفضة الكثافة، طويل الأجل الابتدائية الحصين العصبية الثقافة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء ثقافات صحية طويلة الأمد للخلايا العصبية الأولية في الحصين بكثافة منخفضة للغاية ، من أجل تسهيل وضع العلامات على الكيمياء المناعية ، ودراسة آليات الخلايا العصبية المستقلة. يمكن أن تساعد هذه الدراسة في فهم بعض الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث علم الأعصاب مثل الدراسات حول خصوصية البروتين في التشكل العصبي لوظيفة التطور. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للخلايا العصبية بالنمو بكثافة منخفضة للغاية على زلة الغطاء دون دعم طبقة التغذية الدبقية.

ستظهر الإجراء مارييل بيتشوفيتش ، طالبة من مختبري. قم بإعداد لوحين عالي الكثافة وطبقين منخفضي الكثافة 24 بئرا. باستخدام إبرة قياس 28 ، قم بحفر قاع 24 لوحة بئر ، بحيث تعمل المواد البلاستيكية النازحة كدعم لزلقات الغطاء مع نمو الخلايا العصبية منخفضة الكثافة عليها.

انقل الغطاء الزجاجي المعقم إلى لوحين بسعة 24 بئرا مخصصين للثقافات منخفضة الكثافة. قم بتغطية جميع الألواح الأربعة ب 300 ميكرولتر من 0.1 ملليغرام لكل مليلتر من Poly-D-lysine المخفف في مخزن مؤقت للبورات ، وأعدها إلى الحاضنة لطلاء الحضانة طوال الليل. قبل جمع الأنسجة ، قم بإعداد طبقين بتري بطول 10 سم مملوءين ب HBSS المعقم المثلج.

تحت المجهر ، أمسك الجنين من الرقبة بالملقط ، وقم بإجراء القطع الأول مباشرة على خط الوسط ، أسفل مستوى المخيخ. بعد ذلك ، قم بعمل قطع على الجانب الأيسر من قاعدة الجمجمة. بعد ذلك ، قم بعمل قطع آخر على الجانب الأيمن من قاعدة الجمجمة.

اترك جزءا صغيرا من عظم الجمجمة وأنسجة الجلد في الطرف المنقاري غير مقطوع بحيث يمكن قلب الدماغ كله جانبا لاستخراجه بسهولة. الآن نقل الدماغ إلى محلول HBSS. افحص الدماغ للتأكد من أنه سليم دون مناطق مقطوعة جسيمة.

بعد ذلك ، كرر الإجراءات لجمع بقية أدمغة الجنين في طبق بتري جديد يحتوي على 20 مل من HBSS المخزن المؤقت البارد. ضع كل دماغ مع الجانب البطني لأعلى. أثناء الضغط على الدماغ بالملقط في النهاية الذيلية ، قم بعمل قطع قطريا بين النقطة المنقارية الوسطى والمنطقة الصدغية الذيلية باستخدام ملقط حاد.

كرر هذا لنصف الكرة الآخر. بعد ذلك ، افصل نصفي الكرة الأرضية مع الحصين السليم عن بقية الأنسجة الجذعية للدماغ. كرر الإجراءات لجميع الأدمغة وجمع جميع نصفي الكرة الأرضية المقطعين معا.

ثم قم بإزالة السحايا باستخدام زوجين من الملقط. حدد الحصين النامي كهيكل منحني مطوي داخل الفص الصدغي وفصله عن الأنسجة القشرية المجاورة. اجمع وجمع جميع أنسجة الحصين معا.

في هذا الإجراء ، انقل كل الحصين المقطوع إلى محلول الهضم الأنزيمي في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. بعد ذلك ، ضع الأنبوب داخل حمام مائي واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة. بعد 25 دقيقة ، قم بإزالة محلول الإنزيم بعناية.

ثم أضف خمسة ملليلتر من وسط الغسيل الدافئ ليصل الحجم الإجمالي إلى 10 ملليلتر. اغسل الأنسجة برفق عن طريق قلب الأنبوب ببطء خمس مرات. قم بإزالة وسط الغسيل وأضف 10 مل من وسط الغسيل مرة أخرى لغسل إضافي.

بعد ذلك ، قم بإزالة وسط الغسيل وأضف ثلاثة ملليلتر من وسط الغسيل الدافئ الطازج مرة أخرى. هز الأنبوب يدويا بصرامة 15 مرة لطرد الخلايا العصبية المهضومة من الأنسجة. يجب أن يصبح الوسط عكرا بمجرد فصل الخلايا عن الأنسجة إلى وسط الغسيل.

بعد ذلك ، اجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مليلتر ، مع ترك الأنسجة المتبقية في الأنبوب. بعد ذلك ، أضف ملليلترين آخرين من وسط الغسيل إلى الأنسجة ، وافصل الأنسجة المتبقية برفق عن طريق التخلي باستخدام ماصة بلاستيكية 15 مرة. دع تعليق الخلية يجلس لمدة خمس دقائق قبل تجميعه في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مليلتر يحتوي على الخلايا التي تم جمعها.

ثم احسب كثافة الخلايا العصبية باستخدام مقياس الدم. احسب حجم تعليق الخلية اللازم لإنتاج كثافة 250،000 خلية عصبية لكل مليلتر ، وأضفها إلى أحد الأنبوبين المخروطيين اللذين يحتويان على 30 مل من وسط الزراعة الكامل ، لإنتاج وسط طلاء خليون عصبي عالي الكثافة. انقل 1.2 مل من محلول الخلايا العصبية عالي الكثافة هذا إلى 30 مل أخرى من وسط الثقافة الكامل ، لإنتاج تركيز 10 ، 000 خلية عصبية لكل مليلتر ، واستخدم هذا المحلول لزرع زلات الغطاء منخفضة الكثافة.

في هذا الإجراء ، ضع لوحا من 24 بئرا بقيعان محفورة للخلايا العصبية عالية الكثافة في غطاء المزرعة. قم بإزالة 300 ميكرولتر من الوسط المكيف مسبقا بالفراغ ، ثم قم بطلاء 0.6 مل من تعليق الخلية عالي الكثافة عند 250،000 خلية عصبية لكل مليلتر. ضع الطبقين الآخرين المكونين من 24 بئرا مع زلات غطاء في غطاء المزرعة.

قم بإزالة 300 ميكرولتر من الوسط المكيف مسبقا عن طريق الفراغ ، قبل طلاء 0.6 مل من تعليق الخلية منخفضة الكثافة عند 10،000 خلية عصبية لكل مليلتر على زلات الغطاء. بعد ذلك ، أعد جميع الأطباق الأربعة المكونة من 24 بئرا إلى الحاضنة ، واحتضنها لمدة ساعتين. بعد ذلك ، اقلب زلات الغطاء منخفض الكثافة مع الخلايا العصبية الملتصقة بالثقافة عالية الكثافة وتأكد من أن الخلايا العصبية تواجه بعضها البعض.

بعد ذلك ، أعد اللوحين مع الزراعة المشتركة إلى الحاضنة. قم بإطعام المزارع المشتركة عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من وسط العلف الطازج في DIV خمسة. بعد هذه التغذية الأولية ، أضف 300 ميكرولتر من وسط العلف الطازج بدون السيتوزين أرابينوسيد إلى كل بئر كل أسبوع.

إذا تم الاحتفاظ بالمزرعة لأكثر من شهر ، فاستبدل نصف الوسط بوسط علف طازج كل أسبوع بعد نقطة زمنية واحدة. من الناحية الشكلية ، يجب أن تبدو كل من الخلايا العصبية عالية الكثافة ومنخفضة الكثافة بصحة جيدة لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. هنا ، يتم استخدام وضع العلامات على الكيمياء المناعية للكشف عن نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاماتيرجية الوظيفية التي يتم فيها تصنيف الوحدة الفرعية لمستقبلات NMDA NR1 والوحدة الفرعية لمستقبلات ApoE GluR1 بتلوين مزدوج.

ويمكن تحديد المشابك الوظيفية بسهولة وقياسها كميا باستخدام الصورة J. يتم أيضا تصنيف الخلايا العصبية منخفضة الكثافة بجسم مضاد ضد علامة البروتين المتغصني MAP2 بالاشتراك مع علامة البروتين المحوري p-Tau. تسمح هذه الملصقات المزدوجة بالتمييز الواضح بين التشعبات والمحاور. يمكن أيضا نقل الثقافات منخفضة الكثافة بنجاح باستخدام بلازميدات الحمض النووي باستخدام طرق فوسفات الكالسيوم ، على الرغم من أن معدل التعدي عادة ما يكون منخفضا جدا في مراحل لاحقة.

هذا الشكل أن تعداء EGFP يمكن أن يكشف عن مورفولوجيا الخلايا العصبية ، ويجعل هياكل العمود الفقري المتغصنة الدقيقة مرئية. أخيرا ، كدليل على المفهوم ، يمكن زراعة الخلايا العصبية منخفضة الكثافة للغاية في ظل ظروف تعزز تكوين autapse. يمكن الحفاظ على هذه الخلايا العصبية التلقائية منخفضة الكثافة للغاية المزروعة على الجزر الدقيقة المطلية ب Poly-D-lysine بواسطة الخلايا العصبية المغذية عالية الكثافة لأكثر من شهرين باستخدام بروتوكول الزراعة المشتركة هذا.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات في يوم زراعة الخلايا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من الأهمية بمكان طلاء زلات الغطاء الزجاجي وقيعان الألواح المكونة من 24 بئرا باستخدام Poly-D-lysine. يكفي حفر بسيط لقيعان اللوحة لتوفير الدعم الميكانيكي والتغذوي للخلايا العصبية منخفضة الكثافة في الحصين لتنمو على زلات الغطاء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة الخلايا العصبية الجنينية الأولية للفأر منخفضة الكثافة ، في حالة عدم وجود طبقة تغذية دبقية. نأمل أن تتمكن من استخدام هذه الطريقة لغرضك التجريبي الخاص.