التصميم ومعالجة السطوح، التصفيحات الخلوية، والتثقيف من وحدات الشبكات العصبية تتكون من الدوائر وظيفيا بين اتصال

توضح هذه المخطوطة بروتوكول لتنمو في الشبكات وحدات المختبر يتكون من محصورة مكانيا، وظيفيا المترابطة الدوائر العصبية. ويستخدم قناع البوليمرية لنمط طبقة البروتين لتعزيز التصاق الخلايا على الركيزة زراعة. الخلايا العصبية مطلي تنمو على المناطق المغلفة إقامة صلات عفوية وعرض النشاط الكهربية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو النمو في الشبكات المعيارية في المختبر التي تتكون من دوائر عصبية محصورة مكانيا ووظيفية ومترابطة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير استنسل PDMS أولا لنمط طبقة بروتينية لتعزيز الالتصاق الخلوي على ركيزة الزراعة. الخطوة الثانية هي تنظيف ركائز الزراعة.

على وجه التحديد أسطح أطباق بتري وزلات الغطاء ومصفوفات الأقطاب الكهربائية المتعددة. بعد ذلك ، يتم ترسيب استنسل PDMS على ركيزة الاستزراع ويتم إنشاء أنماط طبقة البروتين اللاصقة المطلوبة. الخطوة الأخيرة هي طلاء الخلايا الدبقية العصبية.

في النهاية ، يتم استخدام تسجيلات مصفوفة الأقطاب الكهربائية المتعددة وتصوير الكالسيوم لإظهار ديناميكيات الشبكات العصبية المعيارية المحققة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المفتوحة في مجال علم الأعصاب ، مثل التحقيق في ديناميكيات الاتصال بين التجمعات العصبية ، وستكون هناك ظروف تجريبية مضادة. يتم تصنيع بولي ميثيل سوان أو PDMS عن طريق خلط عامل معالجة جزء واحد أولا مع 10 أجزاء من العامل الأساسي.

بعد خمس دقائق من الخلط ، انقل الخليط إلى غرفة مفرغة لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، تحقق من وجود فقاعات وأعد المحلول إلى الغرفة لمدة 15 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، قم بإعداد رقاقة على المبرمج الدوراني.

افتح مقابض الغاز لغاز النيتروجين. ضع رقاقة على الدوار وثبتها في مكانها باستخدام المكنسة الكهربائية. ثم صب طبقة رقيقة من PDMS فوق الرقاقة.

قم بتدوير الرقاقة باستخدام PDMS لمدة دقيقة عند 1000 دورة في الدقيقة لعمل طلاء PDMS بسمك 100 ميكرون على الرقاقة. ثم انقل الرقاقة إلى طبق ساخن على حرارة 100 درجة مئوية. دعها تخبز هناك لمدة 30 دقيقة.

بعد تصلب نظام إدارة الإستنسل الثابت، استخدم ماصة لتحديد حدود الإستنسل بمزيد من نظام إدارة الأرقام الرقمية. ثم اخبز PDMS المضاف على الرقاقة. كما كان من قبل ، عندما تصلب حدود PDMS ، قم بقص الاستنسل على طول الحدود لإزالة استنسل السيليكون من الرقاقة لبدء RINs.

ينزلق غطاء زجاجي مربع 23 ملم بالماء المقطر ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم الأسيتون ، ثم الأيزوبروبانول ، وأخيرا الماء المقطر. مرة أخرى ، جفف المربعات تحت تيار غاز النيتروجين. بعد ذلك ، اضغط برفق على استنسل PDMS بنمط واحد على كل زلة غطاء.

ضع زلات الغطاء مع الإستنسل في غرفة مفرغة لمدة 15 دقيقة. بمجرد تنظيفها بالمكنسة الكهربائية ، قم بإسقاط مليلتر من PDL على الإستنسل وأعد التجميعات إلى غرفة التفريغ لمدة 20 دقيقة. كرر دورة التفريغ لمدة 20 دقيقة مرة واحدة ، ثم اترك PDL يجف طوال الليل في اليوم التالي.

قم بإعداد أطباق بتري التي ستدعم خلايا الشبكات. أولا. قم بتغطية أطباق 3.5 سم بمليلتر من PDL لمدة ساعتين. في درجة حرارة الغرفة لاحقا ، قم بإزالة PDL من الطبق عن طريق الشفط.

ثم اغسل الأطباق بالماء المقطر واتركها حتى تجف. بمجرد تجفيف الطبق ، أضف كمية صغيرة من شحم السيليكون إلى الطبق وفقا للزوايا الأربع لزلة الغطاء. ضع زلات الغطاء على الطبق بحيث يكون نظام إدارة الرسومات الشخصي متجها لأعلى واضغط عليها برفق لأسفل للتأكد من توصيلها.

الآن الملقط برفق A-P-D-M-S من زلات الغطاء تاركا نمط PDL. أخيرا ، قم بتعقيم الأطباق عن طريق تعريضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة سبع دقائق. أولا ، قم بتنظيف مجموعة الأقطاب الكهربائية المتعددة عن طريق غسلها تحت ماء الصنبور ثم صوتنها في منظف إنزيمي مركز.

كرر هذه الخطوات ثلاث مرات. ثم صوتنة MEA في الماء المقطر النقي ثلاث مرات وبعد ذلك تحت غطاء محرك السيارة. اغسل MEA بالماء المقطر من قبل.

تعقيمه بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإعداد الشبكة الداعمة أولا. صب PDMS في طبق 12 أو 24 بئر.

بمجرد أن تصلب PDMS ، قم بإزالته بإبرة. الآن قم بقطع الثقوب في وسط الأقراص لعمل حلقات تعمل كدعم للقالب. الآن ضع دعامة القالب في وسط منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا وقم بتغطية السطح الخارجي المكشوف لمنطقة الشرق الأوسط وأفريقيا.

دع هذا يستقر لمدة ساعتين في الغرفة. ثم قم بشفط غسل PDL ، السطح الخارجي المكشوف لمنطقة الشرق الأوسط وإفريقيا بالماء المقطر ، وقم بإزالة دعامة القالب حتى يمكن السماح لمنطقة الشرق الأوسط وأفريقيا بالجفاف. الآن قم بإرفاق استنسل بمناور دقيق معد تحت مجهر مقلوب.

افحص الهيكل المزخرف ومحاذاة لمطابقة أقطاب MEA. ثم استخدم المعالج الدقيق لخفض الاستنسل إلى سطح MEA. بمجرد توصيله ، ارفع مناور الميكرومتر وإذا لزم الأمر ، استخدم الملقط لتطبيق قدر صغير من الضغط لمنع PDMS من الانفصال.

الآن انقل MEA إلى غرفة التفريغ لمدة 15 دقيقة. ثم ضع قطرة مليلتر واحدة من PDL على الاستنسل والعودة إلى غرفة التفريغ لمدة دورتين مدة كل منهما 20 دقيقة. دع PDL يجف طوال الليل في اليوم التالي.

قم بإزالة استنسل P DM S من الميزات باستخدام الملقط. أخيرا ، تقوم الأشعة فوق البنفسجية بتعقيم المياز لمدة سبع دقائق. ثم يكونون جاهزين للخلايا في تحضير خلايا المزرعة وإعداد المعلقات كما في بروتوكول النص.

بعد تعليق Resus العدد المطلوب من الخلايا ، قم بوضعها في وسط المنطقة المزخرفة في MEA أو زلة الغطاء. يجب تحميل MEA بأحجام 100 ميكرولتر وقلة غطاء. يستوعب 1000 ميكرولتر.

احتضن خلايا الصفيحة لمدة 40 دقيقة ، ثم أضف وسط الطلاء للحفاظ على الخلايا كل أربعة أيام. أضف وسط النمو الطازج المكملات مرة أخرى. بعد اليوم السادس أو السابع ، يجب أن تبدأ الوصلات العصبية بين الوحدات في التكون في تلك المرحلة.

قم بتخفيف وسط الثقافة بعامل مضاد للانقسام لمنع فرط النمو الدبقي. بعد أربعة أيام في المختبر ، من الممكن ملاحظة أن الخلايا العصبية المرتبطة داخل PD DL تشفر ببقع 600 ميكرون مربع بعد 14 يوما. في الثقافة ، أنشأت الخلايا العصبية اتصالا تلقائيا داخل الوحدات وبين الوحدات التي تشكل شبكات وظيفية نشطة.

لوحظت الدوائر العصبية التي تبلغ مساحتها 300 ميكرون مربع من خلال وجود حجم ميزة PDMS مع الحفاظ على نفس تركيز الطلاء. تم إجراء تصوير الكالسيوم باستخدام هدف الفوركس للنشاط على نطاق واسع في الشبكات المستزرعة. بين الوحدتين الخضراء والوردية ، يظهر عدد أكبر من الاتصالات بينما تكون الوحدات الزرقاء والحمراء أقل ارتباطا بالوحدات الأخرى.

يتم عرض مخطط قائمة لأحداث الكالسيوم لفيلم تم الحصول عليه بسرعة 30 هرتز مع صورة 1 مليون بكسل. كانت الوحدات الخضراء والوردية متزامنة للغاية ، في حين كانت الوحدات الزرقاء والحمراء أقل. وبالتالي.تم تسجيل شبكة معيارية قشرية تتكون من ثلاث دوائر متميزة في 21 يوما في المختبر.

باستخدام دوائر عصبية MEA ، تم العثور على حدود 600 ميكرون مترابطة. تم إعادة بناء نشاطهم الفيزيولوجي الكهربي. باستخدام خوارزمية دقيقة للكشف عن ارتفاع التوقيت ، تم عمل مخطط قائمة من خمس دقائق من هذه البيانات باستخدام بيانات الكتلة المشفرة بالألوان.

يوفر هذا مقارنة لنشاط الشبكة بأكملها ونظام المجموعة الفردي ويعطي نظرة ثاقبة على التزامن داخل نظام المجموعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير استنسل PDM واستخدامها لنمط التصاق الخلايا الدبقية العصبية مما يؤدي إلى إنشاء شبكة مشروطة وظيفية.