الجيل القادم التسلسل للكشف عن المنحى الطفرات في الأورام الصلبة والسائلة

الهدف العام من هذا التسلسل المستهدف من الجيل التالي هو اكتشاف الطفرات المسببة للأمراض في أورام المرضى للاستخدام العلاجي ، بما في ذلك التشخيص والتشخيص والاستجابة للعلاج الموجه. تجيب هذه الطريقة على الأسئلة الرئيسية ، مثل ما إذا كان المريض لديه طفرة في جين يمكن أن يستفيد من علاج مستهدف أو بديل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن اكتشاف الطفرات القابلة للتنفيذ ، الشائعة والنادرة ، عبر العديد من الجينات في أي نسيج ورمي باستخدام اختبار واحد.

نظرا لأن التقنيات والتكنولوجيا معقدة للغاية ويصعب تعلم الخطوات ، فمن الأهمية بمكان إظهار هذه الطريقة بصريا. هذه لحظة حاسمة في تطوير علم الأورام الطبي. مع اعتماد تسلسل الجيل التالي في العيادة ، سيكون لدينا علاجات سرطان أكثر وأفضل لمرضانا.

سيوضح تقنيو CPD لدينا ، Barentt Li و Patrick Candrea, Karthik Ganapathy, و Joe Grubb هذا الإجراء. سأساعد أيضا في هذه العملية لإظهار الأجزاء الأكثر تعقيدا من الفحص. بعد استخراج الحمض النووي الجيني وفقا لبروتوكول النص ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة ، قم بتشغيل ميكرولترين من الحمض النووي المستخرج على مقياس فلوري للحصول على تركيز عمل العينة.

لإنشاء مكتبة Amplicon ، في صفيحة نصف حوارية مكونة من 96 بئرا تسمى Hyb Plate ، أضف الحجم اللازم من EDTA TE المنخفض ، وخمسة ميركولتر من أنبوب Oligo الخاص باللوحة ، أضف 100 إلى 250 نانوغراما من الحمض النووي الجيني إلى كل بئر مقابل. هذه هي الخطوة الوحيدة الأكثر حيوية ، لأن أي خلط هنا سيكون له عواقب وخيمة. بعد إضافة Oligo Hybridization for Sequencing Reagent 1 ، والدوران وفقا لبروتوكول النص ، قم باحتضان Hyb Plate في حاضنة التهجين المسخنة مسبقا عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.

بعد تبريد الحاضنة ببطء إلى 40 درجة مئوية ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ، وانقل الحجم الكامل لكل عينة من Hyb Plate إلى مركز وحدة لوحة الترشيح المعدة مسبقا أو FPU. قم بتغطية FPU وجهاز الطرد المركزي عند 2 ، 250 مرة G و 20 درجة مئوية من ثلاث دقائق. ثم أضف 45 ميكرولترا من SW1 ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.

بعد الغسيل الثاني باستخدام SW1 والغسيل باستخدام UB1 ، أضف 45 ميكرولترا من مزيج ربط التمديد 3 إلى كل عينة جيدا ، وقم بتثبيتها لأعلى ولأسفل ثلاث مرات للخلط. استخدم رقائق الألومنيوم اللاصقة لإغلاق اللوحة ، واحتضان مجموعة FPU بالكامل في حاضنة مسخنة مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. لفهرسة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بترتيب الاشعال في لوحة تضخيم الفهرس ، أو تركيبات IAP ، وقم بتقسيم الفهارس المستخدمة في الآبار المقابلة في اللوحة ، ثم أضف 22 ميكرولترا من PCR Master Mix ، 2E12 ، وأضعبها لأعلى ولأسفل ثلاث مرات.

بعد ذلك ، بعد تدوير تفاعل ربط التمديد لمدة 45 دقيقة وفقا لبروتوكول النص ، أضف 25 ميكرولترا من هيدروكسيد الصوديوم 50 مللي مولار إلى كل عينة من بئر FPU ، وقم بتثبيته لأعلى ولأسفل ست مرات على الأقل ، مما يضمن ملامسة طرف الماصة للغشاء. ثم مع إمالة اللوحة قليلا وضبط الماصة متعددة القنوات على 20 ميكرولترا، قم بتمرير الماصة لهيدروكسيد الصوديوم في لوحة FPU لأعلى ولأسفل ست مرات على الأقل. انقل الشطف من FPU إلى العمود المقابل من IAP.

قم بتمرير الماصة برفق لأعلى ولأسفل لدمج الحمض النووي تماما مع PCR Master Mix قبل تشغيل برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضح في بروتوكول النص. بعد التحقق من إنتاجية المكتبة واحتضان العينات بخرز التنقية المغناطيسي وفقا لبروتوكول النص ، أضف 30 ميكرولترا من EBT إلى كل بئر من الخرز المغسول. الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان خروج الخرزات من جانب الأنبوب.

بمجرد احتضان اللوحة ثم بدون اهتزاز ، ضع اللوحة على الحامل المغناطيسي وانقل 20 ميكرولترا من المادة الطافية إلى لوحة جديدة بالكامل تسمى لوحة تطبيع المكتبة ، أو LNP. بعد تحضير مزيج التطبيع ، مع الانعكاس المتقطع ، ودوامة المحلول ، أضف 45 ميكرولترا إلى كل عينة من LNP. بعد ذلك ، استخدم طبقة لاصقة شفافة لإغلاق اللوحة ، ورجها عند 1 ، 800 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.

بعد غسل الخرزات ، قم بإزالة LNP من الحامل المغناطيسي ولإزالة العينة ، أضف 30 ميكرولترا من هيدروكسيد الصوديوم العادي الطازج 0.1 إلى كل بئر. ثم قم بهز LNP بمعدل 1 ، 800 RMP لمدة خمس دقائق. ضع LNP مرة أخرى على الحامل المغناطيسي ، وبعد مسح المادة الطافية ، انقل 30 ميكرولترا من الشطف إلى المخزن المؤقت لتخزين تطبيع المكتبة المعد مسبقا 1 في لوحة التخزين.

قم بثني اللوحة ، ثم أضف خمسة ميكرولترات من كل عينة ليتم تسلسلها إلى مكتبة Amplicon المجمعة المسمى ، أو PAL ، أنبوب 1.5 ملليلتر. اعتمادا على كيمياء التسلسل المستخدمة ، أضف أربعة إلى 10 ميكرولترات من PAL إلى 590 إلى 596 ميكرولتر من Buffer HT1. قم بتنظيف وتحميل خلية التدفق.

قم بتحميل الكواشف. واتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لبدء تشغيل التسلسل. بعد اكتمال تشغيل التسلسل، قم بتنفيذ مسار Bioinfomatics.

قم بتحليل إحصائيات التشغيل للتأكد من أن المكتبة المتسلسلة قد اجتازت مقاييس مراقبة الجودة التي يحددها المختبر. أخيرا ، في عارض البيانات الجينومية ، راجع كل متغير يدويا من خلال عرض ملفات BAM. هذا ملخص لأهم إحصائيات التشغيل ، لا تشمل متوسط التغطية ، المستخدمة لتحديد ما إذا كانت عينة إعداد المكتبة قد مرت QC.As رأينا هنا للحالة الأولى ، اكتشفت المعلوماتية الحيوية أربع طفرات مرتبطة ب AML يمكن الإبلاغ عنها.

ضرورة الخطأ في FLT3 ، وطفرة خاطئة في IDH2 ، وطفرة تغيير الإطار في NPM1. لوحظت طفرات في FLT3 في حوالي 25٪ من المرضى البالغين المصابين بابيضاض الدم النقوي الحاد. الأهمية التنبؤية لطفرات نقطة مجال FLT3 Kinase ، كما رأينا في مريض ابيضاض الدم النقوي الحاد هذا ، لها تأثير غير واضح على التشخيص.

نازعة هيدروجين الإيزوسيترات 2 ، أو IDH2 ، بتشفير معدل لاجني وراثي يتحور عادة في ابيضاض الدم النقوي الحاد. الطفرات في جين النوكليوفوسمين ، أو NPM1 ، هي واحدة من أكثر الطفرات شيوعا في ابيضاض الدم النقوي الحاد. يسرد هذا الجدول جميع المتغيرات الخارجية للحالة الثانية.

تم الكشف عن طفرتين مرتبطتين بالمرض. إدخال في الإطار في Exon 20 من ERBB2 ، وطفرة خاطئة في TP53. HER2 / neu ، أو ERBB2 ، يشفر مستقبلات التيروزين كيناز.

لوحظ تنشيط إدخالات HER2 / neu Exon 20 في اثنين إلى 4٪ من الأورام الغدية الرئوية وتمثل غالبية طفرات HER2 / neu التي لوحظت في سرطان الرئة. تغييرات TP53 شائعة أيضا في السرطان. من الضروري إيلاء اهتمام وثيق لجودة وكمية الحمض النووي المستخرج.

هذا مهم بشكل خاص لعينات FFPE. نحن نحاول غالبا إلى حد كبير متدهورة مع متغير ال [دنا] إنتاج. أثناء عملية التحقق من صحة الفحص السريري ، يجب وضع مقاييس لجودة الحمض النووي وكميته لكل عينة قبل تقديم الحمض النووي إلى إعداد المكتبة.

بالإضافة إلى إعداد المكتبة ، من الأهمية بمكان التحقق من صحة خطة تجسس المعلومات الحيوية ، من خلال تحديد قيم القطع لتشغيل التسلسل ، وإحصاءات مراقبة الجودة ، وإحصائيات إعداد المكتبة ، وعمق شجاعة Amplicon ، والحد الأدنى لتردد الأليل الذي يمكن الإبلاغ عنه. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء إعداد المكتبة في يوم عمل. ولكن ، يتطلب سير عمل الفحص العام مزيدا من الوقت لاستخراج الحمض النووي ، والتسلسل ، ومعالجة البيانات ، ومراجعة المتغيرات.

تم تصميم هذا الإجراء للنظر فقط في طفرات الحمض النووي الجيني في بعض النقاط الساخنة الرئيسية. يمكن إجراء الكتل الأخرى التي تستخدم الحمض النووي الريبي للإجابة على أسئلة إضافية مثل التعبير التفاضلي للجينات ، وربط الأورام الخطرة ، وإعادة الترتيب الهيكلي. التطورات الرئيسية تلوح في الأفق.

سيسمح اعتماد الأتمتة ودمج الترميز الشريطي الجزيئي الفريد للمختبرات بتقليل وقت الاستجابة ، واستخدام مدخلات أقل للعينات ، واكتشاف المتغيرات بتردد أليل منخفض للغاية. كان الكشف عن الطفرات المرتبطة بالمرض في عينات السرطان معيارا للرعاية لعقود. NGS هو نهج أقل تحيزا لتسلسل الجينات المتعددة المرتبطة بالعديد من السرطانات بالتوازي ، مما يؤدي إلى تحديد طفرات متعددة وعلاجات أفضل للمرضى.

شكرا لك على المشاهدة ، ونتمنى لك السعادة في تجاربك.