التكامل بين الرطب والعمليات مقعد الجافة يحسن المستهدفة تسلسل الجيل التالي من ذات جودة منخفضة ومنخفضة كمية التحليلات ورم

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف نظام شامل لتسلسل عينات السرطان الصعبة الذي يجمع بين الكواشف المختبرية الرطبة والضوابط الموحدة والوقوف على طول مجموعة المعلوماتية الحيوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السرطان ، مثل كيفية تسلسل خزعات الورم منخفضة الكمية ومنخفضة الجودة لتحقيق تحليلات وتفسيرات دقيقة لمتغيرات الحمض النووي. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن العينات التي يصعب تسلسلها هي تلك التي تحتوي ببساطة على كميات محدودة من الحمض النووي يمكن تحليلها بسرعة وموثوقية باستخدام الكواشف وأدوات التحكم أحادية المصدر وبرامج المعلوماتية الحيوية المتكاملة تماما.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب تعقيد NGS المستهدف ، والذي تبسطه هذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن إجراءات القياس الكمي للمكتبة وتجميع العينات تتطلب اهتماما خاصا لتحقيق تغطية موحدة عبر جميع مكتبات العينات. يدمج هذا البروتوكول عمليات مقاعد البدلاء الرطبة والجافة لتسلسل عينات السرطان الصعبة.

تتمثل الخطوة الأولى في القياس الكمي وتأهيل الحمض النووي لتحديد عدد نسخ قالب الحمض النووي التي يمكن تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. ابدأ إجراء القياس الكمي للعينة ومراقبة الجودة عن طريق إعداد كمية كافية من المزيج الرئيسي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. استخدم الأحجام التالية لكل عينة ، 5 ميكرولتر من مزيج رئيسي 2x ، و 0.5 ميكرولتر من مزيج المسبار التمهيدي ، و 0.5 ميكرولتر من مزيج المسبار التمهيدي للتثبيط ، و 0.05 ميكرولتر من ROX ، و 2.95 ميكرولتر من المخفف.

أضف تسعة ميكرولترات من المزيج الرئيسي في كل بئر من طبق 96 بئر. أضف ميكرولتر واحد من معايير الحمض النووي في نسختين واخلطها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات. بعد التأكد من خلط عينة الحمض النووي جيدا ، أضف ميكرولتر واحدا من العينة إلى المزيج الرئيسي واخلطه عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل خمس مرات.

ضع اللوحة محكمة الغلق في نظام PCR. إجراء دورات PCR لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية تليها 40 دورة مدة كل منها 15 ثانية عند 95 درجة مئوية ودقيقة واحدة عند 60 درجة مئوية. قم بتحليل بيانات qPCR عن طريق إنشاء مخطط انحدار خطي لكل من معايير الحمض النووي المكررة.

ثم يتم حساب تركيز الحمض النووي المجهول في رقم النسخة الوظيفي أو القابل للتضخيم لكل ميكرولتر كما هو موضح في نص البروتوكول. الخطوة التالية بعد القياس الكمي للعينة ومراقبة الجودة ، هي إثراء تسلسلات النقاط الساخنة للسرطان بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل أحادي الأنبوب. سيتم إجراء جين خاص أو gsPCR لإثراء 46 موقعا في 21 جينا سرطانيا.

قم بإعداد كمية كافية من مزيج gsPCR الرئيسي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام الأحجام التالية لكل عينة ، وخمسة ميكرولترات من مزيج التضخيم الرئيسي 2x ، وميكرولتر واحد من لوحة التمهيدي للسرطان. Aliquot ستة ميكرولترات من gsPCR الرئيسي مزيج في كل بئر من 96 لوحة بئر. أضف أربعة ميكرولترات من كل عينة من الحمض النووي في آبار فردية.

امزج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات. قم بتضمين عناصر التحكم المناسبة. ضع اللوحة المختومة في جهاز تدوير حراري لدورات تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية.

خمس دقائق عند 95 درجة مئوية ، 15 ثانية عند 95 درجة مئوية تليها أربع دقائق عند 60 درجة مئوية لمدة دورتين. 15 ثانية عند 95 درجة مئوية تليها أربع دقائق عند 72 درجة مئوية لمدة 23 دورة.

تمديد نهائي لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية ، يليه الثبات عند أربع درجات مئوية. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالجينات ، قم بإجراء 10 دورات من tag-PCR لدمج محولات خاصة بالنظام الأساسي للتوافق مع تسلسل الجيل التالي. أضف 7.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للمؤشر 2x و 5.5 ميكرولتر من رمز المؤشر إلى بئر محدد في لوح بئر 96 واخلطه عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات.

افتح لوحة gsPCR بعناية وأضف ميكرولترين من منتج gsPCR إلى اللوحة الجديدة مع المزيج الرئيسي. ضع اللوحة المختومة في جهاز التدوير الحراري لدورات تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية ، خمس دقائق عند 95 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 95 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 55 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دورات ، وتمديد نهائي لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. يليه عقد عند أربع درجات مئوية.

بعد tag-PCR ، يتم تنقية المكتبة واختيار الحجم باستخدام كيمياء الخرزة المغناطيسية. ابدأ هذا الإجراء بإضافة 11 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي النقي للمكتبة في آبار منفصلة من لوحة 96 بئر. افتح لوحة tag-PCR وأضف 10 ميكرولترات من منتج tag-PCR إلى الخرزات واخلطها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات.

احتضن الخليط لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع لوحة البئر 96 على حامل مغناطيسي لمدة أربع دقائق. مع بقاء لوح البئر 96 على الحامل ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها باستخدام ماصة.

بعد غسل الخرزات مرتين باستخدام الإيثانول الذي يحتوي على مخزن مؤقت للغسيل كما هو موضح في نص البروتوكول ، جفف الخرزات لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ثم قم بإزالة اللوحة من الحامل. أعد تعليق الخرزات عن طريق إضافة 20 ميكرولترا من محلول الشطف إلى كل بئر وسحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات. احتضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

ضع لوحة البئر 96 مرة أخرى على الحامل المغناطيسي لمدة أربع دقائق وقم بإزالة ونقل 18 ميكرولترا من المادة الطافية الشفافة بعناية إلى بئر في لوحة جديدة سعة 96 جيدا. الخطوة التالية في هذا البروتوكول هي القياس الكمي لكل مكتبة عينات منقاة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي التنافسي النسبي. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد كمية كافية من مزيج LQ الرئيسي في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام الأحجام التالية لكل عينة ، وخمسة ميكرولتر من مزيج LQ الرئيسي 2x ، وميكرولترين من مزيج مسبار LQ التمهيدي ، و 0.5 ميكرولتر من معيار LQ ، و 0.5 ميكرولتر من LQ ROX.

أضف 8 ميكرولترات من مزيج LQ الرئيسي إلى بئر من لوحة بئر بصرية 96. في الآبار المنفصلة ، أضف ميكرولترين من التخفيف التسلسلي للمكتبة ، وميكرولترين من التحكم الإيجابي LQ ، وميكرولترين من مخفف LQ واخلطهم عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل خمس مرات. ضع اللوحة المختومة في نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل وقم بتعيين كاشفات FAM و VIC لكل عينة.

قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام ظروف ركوب الدراجات التالية ، خمس دقائق عند 95 درجة مئوية ، و 15 ثانية عند 95 درجة مئوية ، تليها دقيقة واحدة عند 60 درجة مئوية لمدة 40 دورة. ثم يتم حساب تركيز كل عينة كما هو موضح في نص البروتوكول. بعد القياس الكمي للمكتبة ، يتم تطبيع كل مكتبة عينات بناء على تركيزها المقاس وتجميعها في أنبوب واحد للتسلسل.

يتم استخدام وحدة تحليل مبسطة لتسهيل حسابات تطبيع المكتبة وتجميع العينات. لتطبيع المكتبة ، حدد أولا متوسط التركيز في النانومولار عبر جميع العينات التي تحتوي كل منها على فهرس زوجي فريد ليتم تجميعه. بعد ذلك ، حدد حجم العينة الفردي بالميكرولتر لتجميعه بضرب متوسط التركيز عبر جميع العينات في خمسة ، ثم القسمة على تركيزها الفردي.

أضف الحجم الطبيعي لكل عينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق واحد لإنشاء تجمع العينات. قم بتخفيف مجموعة العينات إلى 1.25 نانومولار باستخدام مخفف التسلسل. قم بإعداد تجمع العينات للتسلسل عن طريق تغيير طبيعته في وجود عنصر تحكم phix V3. اجمع بين ما يلي ، 15 ميكرولترا من مجموعة عينات 1.25 نانومولار ، وثلاثة ميكرولتر من 0.5 نانومولار phix ، واثنين من الميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1N.

بعد دوامة قصيرة وطرد مركزي ، احتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 8 ميكرولترات من المكتبة المشوهة إلى 992 ميكرولترا من المخزن المؤقت العالي HT1 المبرد مسبقا في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أضف 600 ميكرولتر من المكتبة المشوهة والمخففة إلى الموضع رقم 17 من خرطوشة الكاشف.

في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، قم بتخفيف أربعة ميكرولترات بشكل منفصل من كل برايمر تسلسل ب 636 ميكرولتر من المخزن المؤقت العالي HT1. أضف 600 ميكرولتر من بادئات التسلسل المخففة للقراءة 1 إلى الموضع رقم 18 من خرطوشة كاشف التسلسل. 600 ميكرولتر من البادئات المخففة للقراءة إلى الموضع رقم 19 و 600 ميكرولتر من بادئات تسلسل القراءة المخففة 2 إلى الموضع رقم 20.

قم بتحميل الكواشف على أداة تسلسل الجيل التالي وقم بإجراء نهاية مقترنة ، يتم تشغيل تسلسل دورة اثنين × 150 وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. أخيرا ، قم بتحليل بيانات التسلسل باستخدام برنامج المعلوماتية الحيوية المصاحب. يمكن معالجة ما مجموعه 90 عينة في تشغيل NGS واحد باستخدام جهاز التسلسل العلوي على مقاعد البدلاء.

بالنسبة لمجموعة البيانات الموضحة ، تضمنت العينات خط الخلية ، والمتبقي السريري الرسمي والثابت المدمج في البارافين ، أو FFPE ، والحمض النووي للقالب الاصطناعي وأسفرت عن تسلسل عالي العمق وتغطية موحدة. كانت القيم المتطرفة تتألف من عدم وجود عناصر تحكم في القالب ، وسلسلة تخفيف من الحمض النووي لخط خلية واحد مع تضخيم عدد كبير من النسخ ، والحمض النووي FFPE الذي تم وضع علامة عليه لتثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة مقايسة مراقبة الجودة القائمة على qPCR قبل التحليل. تم الحفاظ على توحيد التغطية عبر 46 أمبليكون باستخدام ثلاثة مشغلين مختلفين ولعينات مختلفة من الحمض النووي FFPE منخفضة الجودة.

في خليط التحكم في الحمض النووي للورم FFPE ، الذي يتكون من طفرة معروفة بنسبة 5٪ BRAF V600E ، تم الإبلاغ عن أن لديه طفرة BRAF المستهدفة بمتوسط وفرة 5.2 زائد أو ناقص 1.3 في المائة من قبل ثلاثة مشغلين باستخدام مدخلات 400 نسخة قابلة للتضخيم. تخفيفات خط الخلية وعينات الحمض النووي FFPE مع تضخيم رقم النسخ التي تم إثباتها تعتمد على تضخيم EGFR و KRAS. بشكل غير مؤكد ، يمكن تقليل مدخلات الحمض النووي FFPE إلى أقل من 50 نسخة قابلة للتضخيم أو 1.2 نانوجرام من الحمض النووي السائب.

مع الحفاظ على الكشف عن الطفرات المعروفة دون أي مكالمات إيجابية خاطئة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 11 ساعة مع حوالي ثلاث ساعات ونصف من التدريب العملي في الوقت المحدد لحجم دفعة من 24 عينة في المرة الواحدة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.