طبقة تلو طبقة الكولاجين ترسب في أجهزة ميكروفلويديك لMicrotissue لتحقيق الاستقرار

الهدف العام من هذا الإجراء هو إيداع مجموعة رقيقة من الكولاجين على الخلايا في جهاز ميكروفيليديك. يتم تحقيق ذلك عن طريق تعديل الكولاجين الأصلي المحمض أولا من خلال المثيلة لإنشاء جزيئات كولاجين صافية موجبة الشحنة. الخطوة الثانية هي تعديل الكولاجين الأصلي المحمض من خلال إنشاء جزيئات الكولاجين سالبة الشحنة.

بعد ذلك ، يتم تحضير أجهزة الموائع الدقيقة وبذرها بخلايا الكبد ، والتي يسمح لها بالالتصاق والانتشار طوال الليل. الخطوة الأخيرة هي ترسيب مجموعة الكولاجين عن طريق تعريض الخلايا بالتناوب لمحاليل الكولاجين الموجبة والسالبة لتكوين 10 طبقات ثنائية من الكولاجين فوق طبقة الخلية. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري للطور والتألق المناعي ومقايسات الألبومين واليوريا لإظهار تطور والحفاظ على قطبية الخلية ووظيفة الإفراز.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تمكن من زراعة خلايا الكبد في الأجهزة الدقيقة باستخدام تقنيات مماثلة لتلك المطبقة في مزارع الصفائح لأكثر من 20 عاما. لا يتطلب تصميمات معقدة للأجهزة والمصفوفة المودعة رقيقة جدا في حدود 100 نانومتر. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة أثناء العصف الذهني حول كيفية ترجمة تقنيات زراعة خلايا كابي من الألواح إلى أجهزة الموائع الدقيقة.

تعمل طرق شطيرة الكولاجين في أنظمة مجهرية مفتوحة ، لكن الهلاميات المائية المستخدمة غير متوافقة مع الأجهزة الدقيقة المغلقة ذات ارتفاعات القناة المحدودة. خفف 100 ملليغرام من محلول الكولاجين المحمض الأصلي بتركيز 0.5 ملليغرام لكل مليلتر بالثلج والماء البارد والمعقم ، وضع المحلول على الثلج لمنع التزيين. بعد ذلك ، اضبط درجة الحموضة في محلول الكولاجين إلى ما بين تسعة و 10 مع بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم العادي وحرك المحلول برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

عندما يترسب الكولاجين ، سيبدأ المحلول في التحول إلى غائم ، ويدور محلول الكولاجين المترسب الذي يمتد 3000 مرة إلى 3000 مرة جم لمدة 25 دقيقة. بعد ذلك ، يجب أن يكون الراسب الشفاف الشبيه بالهلام مرئيا في قاع الأنابيب ، واستنشاق snat ، ثم يعلق الكولاجين المترسب في 200 مل من الميثانول مع 0.1 حمض الهيدروكلوريك العادي مما يسمح بحدوث تفاعل المثيلة أثناء التحريك في درجة حرارة الغرفة لمدة أربعة أيام بعد جهاز الطرد المركزي للمثيلة ، المحلول عند 3000 مرة G لمدة 25 دقيقة لحبيبات الكولاجين الميثيلي ، ثم استنشق وتخلص من سوبينات الميثانول المحمض. بعد ذلك ، قم بإذابة الكولاجين الميثيلي في 25 مل من PBS المعقم وقم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 60 ميكرون.

اضبط درجة الحموضة في المحلول على 7.3 إلى 7.4 باستخدام زيادات قدرها 20 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم العادي الواحد. قم بتقييم تركيز محلول الكولاجين باستخدام مجموعة ELIZA لكولاجين الفئران التجارية أو مجموعة فحص هيدروكسي برولين. ثم قم بتخفيف المحلول إلى ثلاثة ملليغرام لكل مليلتر باستخدام PBS المعقم.

عقم محلول الكولاجين الميثيلي عن طريق نقله إلى زجاجة زجاجية بغطاء لولبي. ضع بعناية ثلاثة ملليلتر من الكلوروفورم في قاع الزجاجة والسماح للزجاجة بالثبات طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي.

بشكل معقم ، قم بإزالة طبقة الكولاجين الميثيلية العلوية. قم بتخزين الكولاجين الميثيلي عند أربع درجات مئوية واستخدمه في غضون شهر واحد. قم بتخفيف 100 ملليغرام أخرى من محلول الكولاجين المحمض الأصلي بتركيز 0.5 ملليغرام لكل مليلتر بالثلج والماء البارد والمعقم ، وضع المحلول على الثلج لمنع التأريخ كما هو موضح سابقا ، واضبط درجة الحموضة لمحلول الكولاجين باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحرك المحلول في درجة حرارة الغرفة لترسيب الكولاجين.

بعد ذلك ، قم بإذابة 40 ملليغرام من ستة أنهيدريد حليق في 10 ملليلتر من الأسيتون. أضف هذا الخليط ببطء بزيادات قدرها 0.5 مل إلى محلول الكولاجين أثناء التقليب والمراقبة المستمرة لدرجة الحموضة في المحلول. حافظ على الرقم الهيدروجيني أعلى من 9.0 عن طريق إضافة قطرة أو قطرتين من هيدروكسيد الصوديوم العادي حيث يقترب الرقم الهيدروجيني من 9.0 مع التحريك المستمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 120 دقيقة.

بعد إضافة كل محلول cynic و hydride الستة ، لاحظ أن الخليط يصبح واضحا عندما يذوب الكولاجين السكسينات ، واستمر في فحص درجة الحموضة بشكل دوري للتأكد من بقائها أعلى من 9.0. عندما يذوب كل الكولاجين السكسينات ، اضبط درجة الحموضة في المحلول على 4.0 باستخدام زيادات قدرها 20 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك العادي. راقب المحلول ، ويصبح غائما مرة أخرى مع ترسيب الكولاجين السكسيناتي.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحلول عند 3000 مرة G لمدة 25 دقيقة. لحبيبات الكولاجين السكسينات asbury والتخلص من snat المحمض باستخدام أنهيدريد سنيك غير متفاعل ، قم بإذابة الكولاجين السكسينات مع سحب العينات المتكرر في 25 مل من PBS المعقم ، مما يعطي تركيزا نهائيا يبلغ حوالي ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر. ثم قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 60 ميكرون ، ثم اضبط درجة الحموضة للمحلول إلى ما بين 7.3 و 7.4.

باستخدام زيادات قدرها 20 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم العادي ، قم بتقييم تركيز المحلول باستخدام مجموعة ELIZA للجرذان الكولاجين التجارية أو مجموعة فحص هيدروكسي برولين. ثم قم بتخفيف المحلول إلى ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر. باستخدام PBS المعقم ، قم بتعقيم محلول الكولاجين هذا بنفس طريقة عمل محلول الكولاجين الميثيلي.

ابدأ بتصنيع جهاز ميكروفلويديك باستخدام تقنية قياسية تحتوي على غرف زراعة خلوية بطول 100 ميكرون وعرض 0.4 إلى 1.5 ملم وقنوات بطول واحد إلى 10 ملليمترات لنمو الخلايا. استخدم منظف البلازما لأكسدة أسطح الجهاز وشريحة زجاجية. ثم اضغط على الاثنين معا لتشكيل رابطة.

بعد تعقيم الجهاز عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة على الأقل. املأ الغرفة ب 15 ميكروغراما لكل مليلتر ، فيبرونيكتين في PBS معقم واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك ، راجع الجهاز الذي يحتوي على خلايا كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

في غطاء زراعة الأنسجة ذات التدفق الصفحي ، قم بإعداد كميات كافية من محاليل الكولاجين الميثيلية والميتة ل 10 تطبيقات لكل محلول لكل جهاز ، بالإضافة إلى بضعة ملليلترات متطرفة من الوسائط. احتفظ بالحلول على الجليد. قم بتنظيف الأجهزة بالتناوب ب 20 ميكرولتر من محاليل الكولاجين الميثيلية ثم الكولاجين.

الانتظار دقيقة واحدة بين كل طلب. اغسل الجهاز ما مجموعه 10 مرات لكل محلول. اعمل بسرعة لتقليل مقدار الوقت الذي تكون فيه الخلايا بدون وسائط أثناء زراعة طبقات الكولاجين ، فمن الممكن ملاحظة تراكم الكولاجين ببطء عند مدخل ومخرج جهاز الموائع الدقيقة.

إذا زادت مقاومة تدفق السوائل ، فقم بغسل الجهاز مرة أو مرتين بالوسائط ثم استمر في وضع الطبقات. بعد تطبيق جميع الطبقات ، اشطف الجهاز مرتين بوسائط جديدة وأعد إلى الحاضنة. المثيلة والحركة تغير خصائص شحنة جزيئات الكولاجين.

يزيل Ation المجموعات الموجبة الشحنة ويستبدلها بمجموعات سالبة الشحنة ، وتزيل المثيلة المجموعات سالبة الشحنة ، مما يؤدي إلى تكوين جزيئات صافية موجبة الشحنة ، مما يسمح بترسب طبقة تلو الأخرى لمتغيرات الكولاجين فوق الأسطح المشحونة مثل الخلايا. يمكن طلاء خلايا الكبد الأولية المزروعة على الزجاج المطلي بالفيبرونيكتين داخل جهاز الموائع الدقيقة بهذه الطبقة تلو الأخرى. مجموعة مصفوفة الكولاجين ، ترسب 10 طبقات ثنائية على الخلايا يخلق سماكة طبقة الكولاجين تبلغ حوالي 140 نانومتر من الخلايا الكبدية بدون طبقة من الكولاجين العلوي تلو الأخرى.

تفقد المصفوفة عقد النمط الظاهري المتمايز وترفع عن سطح أجهزة الموائع الدقيقة بمرور الوقت. في المقابل ، تحافظ خلايا الكبد المغطاة بمجموعة كولاجين رقيقة للغاية على مورفولوجيتها المتمايزة ، وقابلية للحياة تزيد عن 90٪ والاستقطاب على مدى 14 يوما. بالإضافة إلى مورفولوجيا استقطاب الخلية للحياة ، فإن تقنية الكولاجين طبقة تلو الأخرى تستعيد وتثبت وظيفة خلايا الكبد الأولية كما هو موضح هنا ، بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ميثيل الكولاجين والسكسينات لإنشاء محاليل كولاجين صافي إيجابية وسالبة الشحنة وكيفية استخدامها في طبقة تلو الأخرى ترسب لإنشاء تجمعات رقيقة من الكولاجين فوق الخلايا في أجهزة الموائع الدقيقة.