طبقة تلو طبقة الكولاجين ترسب في أجهزة ميكروفلويديك لMicrotissue لتحقيق الاستقرار

الهدف العام من هذا الإجراء هو ترسيب تجمع رقيق من الكولاجين فوق الخلايا في جهاز ميكروفلويديك. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تعديل الكولاجين الطبيعي المحمض من خلال عملية الميثلة لإنشاء جزيئات كولاجين ذات شحنة موجبة صافية. وتتمثل الخطوة الثانية في تعديل الكولاجين الطبيعي المحمض من خلال عملية الأستلة لإنشاء جزيئات كولاجين ذات شحنة سالبة صافية.

بعد ذلك، يتم تحضير الأجهزة الموائع الدقيقة واستزراعها بالخلايا الكبدية، مع تركها لتلتصق وتنتشر طوال الليل. وتتمثل الخطوة النهائية في ترسيب تجميع الكولاجين عن طريق تعريض الخلايا بالتناوب لمحاليل الكولاجين ذات الشحنات الموجبة والسالبة لإنشاء 10 طبقات ثنائية من الكولاجين فوق طبقة الخلايا. وفي الختام، يتم استخدام مجهر التباين الطوري ومجهر التألق المناعي، بالإضافة إلى فحوصات الألبومين واليوريا، لإثبات تطور والحفاظ على قطبية الخلايا والوظيفة الإفرازية.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح زراعة الخلايا الكبدية في أجهزة دقيقة باستخدام تقنيات مشابهة لتلك المطبقة في زراعات الأطباق لأكثر من 20 عاماً. كما أنها لا تتطلب تصميمات معقدة للأجهزة، وتكون المصفوفة المترسبة رقيقة جداً في حدود 100 nanometers. لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة أثناء العصف الذهني حول كيفية نقل تقنيات زراعة خلايا Capy من الأطباق إلى الأجهزة الموائعية الدقيقة.

تعمل طرق شطيرة الكولاجين في الأنظمة المجهرية المفتوحة من الأعلى، إلا أن الهيدروجيلات المستخدمة غير متوافقة مع الأجهزة المجهرية المغلقة ذات ارتفاعات القنوات المحدودة. قم بتخفيف 100 milligrams من محلول كولاجين حمضي طبيعي إلى تركيز 0.5 milligrams per milliliter باستخدام ماء معقم بارد ومثلج، وضع المحلول على الثلج لمنع التجلط. بعد ذلك، اضبط الأس الهيدروجيني (pH) لمحلول الكولاجين ليكون بين 9 و10 بإضافة بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 normal، وحرك المحلول بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

مع ترسيب الكولاجين، سيبدأ المحلول في التعكر؛ قم بطرد مركز محلول الكولاجين المترسب بسرعة 3000 ×g لمدة 25 دقيقة. بعد ذلك، يجب أن يظهر راسب واضح يشبه الهلام في قاع الأنابيب، قم بسحب السائل الطافي، ثم أعد تعليق الكولاجين المترسب في 200 milliliters من الميثانول مع 0.1 normal من حمض الهيدروكلوريك، واترك تفاعل الميثيلية يحدث مع التحريك في درجة حرارة الغرفة لمدة أربعة أيام. بعد عملية الميثيلية، قم بطرد مركز المحلول بسرعة 3000 ×g لمدة 25 دقيقة لترسيب الكولاجين المُميثل، ثم اسحب وتخلص من السائل الطافي للميثانول المحمض. بعد ذلك، أذب الكولاجين المُميثل في 25 milliliters من PBS المعقم وقم بترشيح المحلول باستخدام مصفاة خلايا بمسام 60 micron.

اضبط الأس الهيدروجيني (pH) للمحلول ليكون بين 7.3 و7.4 باستخدام زيادات قدرها 20 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 normal. قم بتقييم تركيز محلول الكولاجين باستخدام طقم ELISA تجاري للكولاجين الخاص بالجرذان أو طقم مقايسة الهيدروكسيبرولين. بعد ذلك، خفف المحلول ليصل تركيزه إلى 3 mg/mL باستخدام PBS معقم.

قم بتعقيم محلول الكولاجين الميثيلي عن طريق نقله إلى زجاجة ذات غطاء لولبي. أضف بحذر ثلاث مللي لتر من الكلوروفورم لتكوين طبقة في قاع الزجاجة، واترك الزجاجة تستقر طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي صباح اليوم التالي.

قم بإزالة الطبقة العلوية من الكولاجين الميثيلي بطريقة معقمة. يُحفظ الكولاجين الميثيلي عند درجة حرارة 4 °C ويُستخدم خلال شهر واحد. قم بتخفيف 100 mg أخرى من محلول الكولاجين الحمضي الأصلي (native acidified collagen) إلى تركيز 0.5 mg/mL باستخدام ماء معقم بارد ومثلج، وضع المحلول على الثلج لمنع التجمع كما تم توضيحه سابقاً، ثم اضبط pH محلول الكولاجين باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وقم بتقليب المحلول في درجة حرارة الغرفة لترسيب الكولاجين.

بعد ذلك، يتم إذابة 40 milligrams من six cynic anhydride في 10 milliliters من acetone. يُضاف هذا المزيج ببطء بزيادات قدرها 0.5 milliliter إلى محلول الكولاجين مع التقليب والمراقبة المستمرة لـ pH المحلول. يتم الحفاظ على pH أعلى من 9.0 عن طريق إضافة قطرة أو قطرتين من sodium hydroxide بتركيز one normal عندما يقترب pH من 9.0، مع التقليب المستمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 120 minutes.

بعد إضافة جميع كميات محلول السيانيك والهيدريد الستة، لاحظ تحول الخليط إلى الحالة الشفافة مع ذوبان كولاجين السكسينات، واستمر في فحص الرقم الهيدروجيني pH بشكل دوري للتأكد من بقائه فوق 9.0. وعندما يذوب كل كولاجين السكسينات، اضبط الرقم الهيدروجيني pH للمحلول إلى 4.0 باستخدام زيادات قدرها 20 µL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 1 normal. لاحظ أن المحلول سيعود إلى الحالة العكرة مرة أخرى مع تَرَسُّب كولاجين السكسينات.

بعد ذلك، قم بطرد المحلول مركزياً عند 3000 ×g لمدة 25 دقيقة. ولترسيب كولاجين السكسينات والتخلص من الرائق المحمض الذي يحتوي على أنهيدريد السكسينيك غير المتفاعل، قم بإذابة كولاجين السكسينات عن طريق السحب المتكرر بالمصّة في 25 milliliters من محلول PBS المعقم، بحيث يكون التركيز النهائي حوالي 3 mg/mL. ثم قم بترشيح المحلول باستخدام مصفاة خلايا بقطر 60 micron، وبعد ذلك اضبط pH المحلول ليكون بين 7.3 و 7.4.

باستخدام زيادات قدرها 20 µL من هيدروكسيد الصوديوم العادي، قم بتقدير تركيز المحلول باستخدام طقم ELISA تجاري للكولاجين الخاص بالجرذان أو طقم مقايسة الهيدروكسي برولين. ثم خفف المحلول ليصل إلى تركيز 3 mg/mL. وباستخدام PBS معقم، قم بتعقيم محلول الكولاجين المُعد هذا بنفس طريقة تعقيم محلول الكولاجين الميثيلي.

ابدأ بتصنيع جهاز مائعات مجهرية باستخدام تقنية قياسية، بحيث يحتوي على غرف زراعة خلايا ذات قنوات لنمو الخلايا بارتفاع 100 microns، وعرض يتراوح من 0.4 إلى 1.5 millimeters، وطول من واحد إلى 10 millimeters. استخدم منظف بلازما لأكسدة أسطح الجهاز وشريحة زجاجية، ثم اضغطهما معاً لتكوين رابطة.

بعد تعقيم الجهاز بتعريضه للأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 دقيقة على الأقل، املأ الحجرة بـ 15 µg/mL من الفيبرونيكتين (fibronectin) في محلول PBS معقم، ثم حضنها عند درجة حرارة 37 °C لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، قم بملء الجهاز بالخلايا كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

داخل غطاء زراعة الأنسجة ذو التدفق الصفائحي، قم بتحضير أحجام كافية من محاليل الكولاجين الممثيلة (methylated) والكولاجين غير الممثيلة (ated) تكفي لـ 10 تطبيقات من كل محلول لكل جهاز، بالإضافة إلى بضع مللي لترات إضافية من الوسط الغذائي. حافظ على المحاليل مبردة على الثلج. قم بغسل الأجهزة بالتناوب باستخدام 20 µL من محلول الكولاجين الممثيلة ثم محلول الكولاجين غير الممثيلة.

الانتظار لمدة دقيقة واحدة بين كل عملية إضافة. يتم غسل الجهاز بإجمالي 10 مرات لكل محلول. يجب العمل بسرعة لتقليل الوقت الذي تظل فيه الخلايا بدون وسط غذائي، وأثناء نمو طبقات الكولاجين، يمكن ملاحظة تراكم الكولاجين ببطء عند مدخل ومخرج الجهاز الموائع الدقيقة.

إذا زادت مقاومة تدفق السوائل، قم بشطف الجهاز مرة أو مرتين باستخدام الوسط الغذائي، ثم واصل عملية الترسيب الطبقي. بعد تطبيق جميع الطبقات، اشطف الجهاز مرتين بوسط غذائي جديد وأعده إلى الحاضنة. تؤدي عملية الميثيلة والأسيتيلة إلى تغيير خصائص الشحنة لجزيئات الكولاجين.

تعمل عملية الأسيتيلة على إزالة المجموعات ذات الشحنة الموجبة واستبدالها بمجموعات ذات شحنة سالبة، بينما تعمل عملية الميثيلة على إزالة المجموعات ذات الشحنة السالبة، مما ينتج جزيئات ذات شحنة موجبة كلية، وهو ما يسمح بترسيب طبقة تلو الأخرى من متغيري الكولاجين على الأسطح المشحونة مثل الخلايا. ويمكن تغطية الخلايا الكبدية الأولية المزروعة على زجاج مطلي بالفبرونيكتين داخل جهاز مائع مجهري بهذه الطريقة (طبقة تلو الأخرى). وعند تجميع مصفوفة الكولاجين، فإن ترسيب 10 طبقات ثنائية على الخلايا يؤدي إلى تكوين طبقة كولاجين بسماكة تبلغ حوالي 140 nanometers للخلايا الكبدية التي لا تحتوي على طبقة كولاجين علوية بنظام طبقة تلو الأخرى.

تفقد المصفوفة نمطها الظاهري المتمايز وتتقلص وتنفصل عن سطح الأجهزة الموائع دقيقة بمرور الوقت. وفي المقابل، تحافظ الخلايا الكبدية المغطاة بتجمع كولاجين فائق الرقة على مورفولوجيتها المتمايزة، وحيوية تزيد عن 90%، والاستقطاب على مدار 14 يوماً. بالإضافة إلى حيوية الخلايا والمورفولوجيا والاستقطاب، تعمل تقنية ترسيب الكولاجين طبقة تلو الأخرى أيضاً على استعادة واستقرار وظيفة الخلايا الكبدية الأولية كما هو موضح هنا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية ميثلة وسكسنة الكولاجين لإنشاء محاليل كولاجين ذات شحنات موجبة وسالبة صافية، وكيفية استخدامها في الترسيب طبقة تلو الأخرى لإنشاء تجمعات كولاجين رقيقة فوق الخلايا في أجهزة الموائع دقيقة.