الهندسة 3D Cellularized الهلام الكولاجين لتجديد الأنسجة الوعائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو هندسة التركيبات الأنبوبية لتجديد أنسجة الأوعية الدموية. يتم تحقيق ذلك من خلال الجمع أولا بين الكولاجين من النوع الأول وخلايا العضلات الملساء في الهندسة الأسطوانية باستخدام تقنية التشكيل. الخطوة الثانية هي إنضاج البناء في مفاعل حيوي ثابت مصمم خصيصا.

بعد ذلك ، يتم حصاد التركيبات الناضجة بعناية ويتم وضع الخلايا البطانية على تجويف البناء باستخدام مفاعل مفاعل حيوي دوار الجدار في النهاية ، يتم إجراء الأنسجة والمقايسات الأيضية والاختبارات الميكانيكية لتقييم خصائص هذه التركيبات الأنبوبية. تكمن أصالة هذه التقنية في أنها تستخدم خطوة واحدة فقط للجمع بين الخلايا والكولاجين لإنتاج بنية مهندس الأنسجة بخصائص ميكانيكية مستهدفة دون أي علاج فيزيائي أو كيميائي إضافي.

علاوة على ذلك ، يمكن التلاعب بالهيكل بسهولة بفضل مقابض التصميم على وجه التحديد ، والتي تسمح بمعالجتها وروابط النهاية. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في التفاعل بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية أثناء النمو وإعادة التشكيل لتجديد أنسجة الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيقه على عدد من الأنسجة المستهدفة ، مثل الأوتار ، وترقيع الجلد ، ورقعة القلب ، والجهاز العصبي.

للبدء في تصنيع وتجميع المفاعل الحيوي الثابت كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب المتضمن تفاصيل عن الخزان والشاش ، وتصنيع المقبض ، وغطاء المغزل ، وتجميع قوالب الإسكان وتقنيات التعقيم. بعد ذلك ، قم بتوسيع خلايا العضلات الملساء الأبهري الخنازير في قارورة زراعة الأنسجة التي تبلغ مساحتها 175 سنتيمترا مربعا حتى تصبح ملتصقة بنسبة 90٪. باستخدام تقنيات الاستزراع القياسية ، قم بحصاد الخلايا ثم إعادة تعليقها عند 4 ملايين خلية لكل مليلتر في وسط مزرعة كامل.

بعد ذلك ، اجمع بين جزء واحد من محلول عازلة ، وجزأين من محلول الكولاجين المعقم بمقدار أربعة جرامات لكل لتر وجزء واحد من تعليق الخلية. بهذا الترتيب ، قم بقياس درجة الحموضة في الخليط وتأكد من أنه بين الرقم الهيدروجيني 7.0 و 7.4. ثم صب خليط الكولاجين الخلية برفق في مجمع قالب الإسكان المجمع.

تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الخليط. دع جل الكولاجين يجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في بيئة معقمة. بعد ساعة واحدة ، قم بإزالة أنبوب السكن وانقل الهيكل بعناية إلى الخزان الذي يحتوي على 35 مل من وسط الاستزراع الدافئ.

احتضان البناء في وضع رأسي لمدة أسبوع أو أسبوعين من النضج الثابت. قم بتغيير وسط الاستزراع كل يومين عن طريق شفط الوسط القديم من منفذ الحاجز السفلي وإعادة ملء الخزان بكمية مكافئة من المزرعة الطازجة. متوسط. إذا رغبت في ذلك ، اجمع ملليلتر واحد من وسط الاستزراع القديم والطازج في كل تبادل وسائط للتحليل الكيميائي الحيوي كل ساعة لمدة 12 ساعة الأولى وكل 24 ساعة بعد ذلك.

قم بإزالة الهيكل من وسط الاستزراع في ظل ظروف معقمة وضعه بشكل متعامد في مسار مقياس التداخل بالليزر المسح الضوئي لقياس سمك البناء بعد أسبوع إلى أسبوعين من النضج الساكن. انقل المفاعل الحيوي إلى غطاء مزرعة الخلية وقم بإزالة الهيكل برفق من مغزله. بمجرد أن تتحرر ، ضعه في طبق بتري بقطر 100 ملم يحتوي على 40 مل من وسط الاستزراع الطازج.

بعد ذلك ، قم بإعداد جهاز اختبار ميكانيكي دقيق مزود بخلية تحميل من خمسة إلى 10 نيوتن ومقابض تمتد إلى حمام PBS يتم الاحتفاظ به عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة الهيكل من طبق Petri الخاص به وقم بتوصيله بأجهزة الإمساك المتخصصة للاختبارات الطولية ومصممة للاتصال بجزء الشاش من البناء دون سحق الجل. استخدم شريط التفلون لمنع أي انزلاق لأجهزة الإمساك أثناء الاختبار.

ثم قم بتركيب الهيكل على جهاز الاختبار الميكانيكي الدقيق. بعد ذلك ، قم بإجراء اختبار التعب على الاتجاه الطولي عن طريق تمديد الهيكل أولا إلى طول المقياس الأولي والاحتفاظ به هناك لمدة 10 دقائق. ثم قم بتطبيق 30 دورة من سلالة دورية 10٪ بمعدل 5٪ في الثانية.

قم بزيادة الإجهاد بخطوات تدريجية بنسبة 10٪ من الإجهاد الدوري حتى تفشل العينة في إجراء الاختبارات في الاتجاه المحيطي. القسم الأول من العينة إلى تركيبات حلقة بطول 10 ملم. ثم قم بتركيب الحلقات على قضبان من الفولاذ المقاوم للصدأ تستخدم بدلا من المقابض.

كما هو الحال مع اختبارات الاتجاه الطولي ، أولا ، قم بتمديد الهيكل إلى طول المقياس الأولي واحتفظ به هناك لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتطبيق 30 دورة من سلالة دورية بنسبة 10٪ بمعدل 5٪ في الثانية. بمجرد أن ينضج البناء وإزالته من مغزله ، قم بإصلاح الهيكل الذي ينتهي بالخزان وضعه في مجموعة الخزان.

كما هو موضح هنا. املأ الجزء الخارجي من الخزان ب 30 مل من الثقافة. متوسط. بعد ذلك ، املأ 75٪ من الحجم اللمعي للبناء بمزيج من البروتينات ، ثم أغلق طرفي البناء.

لتجنب أي تسرب لمحلول البروتين ، ضع المفاعل الحيوي داخل حاضنة وقم بتدوير المفاعل الحيوي عند 4.02 في 10 إلى سالب خمسة GForce لمدة ساعة واحدة لتغطية السطح اللمعي بالبروتينات أثناء طلاء الإلواء. حصاد خلايا الوريد السري البشري والخلايا العشرفية المزروعة بالتقنيات القياسية عندما تكون 90٪ ملتقية ، تعلق الخلايا وتكمل وسط الثقافة M1 99. بعد ذلك ، انظر إلى الوريد السري البشري وخلايا الظهارة البولية في تجويف البناء.

بكثافة 1000 خلية لكل سنتيمتر مربع ، أغلق الأطراف العلوية للبناء لتجنب أي تسرب لمحلول الخلية. احتضان التركيبات المستضافة في ثقافة المفاعل الحيوي للجدار الدوار لمدة يومين بدوران ثابت 4.02 في 10 إلى قوة 5G السالبة. أثناء النضج الثابت لهياكل الأوعية الدموية ، انخفض القطر الخارجي لهياكل الارتفاع الخلوي بسرعة.

كما هو موضح هنا ، انخفض قطر التركيبات بنسبة 60٪ من قيمتها الأولية في اليوم الأول من الثقافة الثابتة. بحلول اليوم السابع ، خفضت التركيبات ما يقرب من 85٪ ، اتبعت كل من دورات الإجهاد الطولية والمحيطية للتركيبات خصائص لزجة مرنة نموذجية للتركيبات القائمة على الكولاجين. بشكل عام ، كانت التركيبات أقوى في الاتجاه الطولي مقارنة بالاتجاه المحيطي في نفس نطاق الإجهاد ، وأظهر تلطيخ ماسين tricone الذي تم إجراؤه على التركيبات البطانية بطانة متجانسة للغاية.

أظهرت خلايا العضلات الملساء مورفولوجيا على شكل المغزل وظهرت مشتتة بشكل متجانس عبر الجدار بينما ظهرت الخلايا البطانية منتشرة بشكل جيد على الجانب اللمعي. بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في الميكانيكا الحيوية والطب التجديدي لاستكشاف السلوك الميكانيكي للأنسجة الهندسية والأصلية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية هندسة تركيبات الأوعية الدموية بسرعة وتصبح أخيرا قوية بما يكفي للتعامل معها واستخدامها في التكييف الميكانيكي في جهاز ديناميكي. نأمل أن تكون جهودنا ونتائجنا قد أقنعتك بالإمكانيات العالية للخلايا فينموذج المصفوفة خارج الخلية لتطوير الأنسجة الوظيفية البيولوجية.