DNA ستراند المهجرين غيتس لشبكات التفاعل التنفيذية الكيميائية المشتقة من البلازميد

الهدف العام من هذا الإجراء هو اشتقاق بوابات إزاحة خيوط الحمض النووي من البلازميدات البكتيرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم البلازميد البكتيري كمصدر نقي للغاية لتوليد بوابات DNA قوية. سيظهر هذا الإجراء زملائي سام ديب وأنا لبدء الإنتاج الضخم ثم عزل بوابات الحمض النووي المحتوية باستخدام مجموعات عزل الحمض النووي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب ووفقا لتعليمات الشركة المصنعة باتباع ellucian.

قياس تركيز الحمض النووي البلازميد باستخدام التقنيات القياسية. ثم قم بهضم الحمض النووي عن طريق إضافة أربع وحدات من إنزيم التقييد PV U2 HF لكل ملليغرام من البلازميد. بعد ذلك ، أضف مجلدين مكافئين من الإيثانول المطلق المثلج البارد إلى العينة.

احتضان الخليط عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة على الأقل لترسيب الحمض النووي. ثم قم بتكسير الحمض النووي المترسب عن طريق الطرد المركزي للعينة عند 10 ، 000 إلى 14 ، 000 مرة جم وصفر درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة SNAT وأضف 1000 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 95٪ إيثانول إلى العينة.

ثم اقلب العينة من 10 إلى 15 مرة بعد ذلك ، وقم بالطرد المركزي للعينة عند 10 ، 000 إلى 14 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. عند الانتهاء ، قم بإزالة المادة الطافية وجفف الحمض النووي بالهواء على مقعد لمدة 10 إلى 20 دقيقة. عند إزالة المادة الطافية من الحمض النووي المترسب ، احرص على عدم إزعاج الحبيبات وإلا سينخفض العائد بشكل كبير.

بمجرد أن تجف ، قم بتعليق حبيبات الحمض النووي في ما يصل إلى 200 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز والدوامة للخلط. ستؤدي إضافة أكثر من 200 ميكرولتر من الماء إلى تخفيف العينة بشكل عام للاستخدام. في تجارب الحركية ، قم بقياس الحمض النووي المعلق باستخدام مقياس الطيف الضوئي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

ثم أضف أربع وحدات من إنزيم التقطيع M-B-B-S-R-D واحدة لكل ميكروغرام واحد من البلازميد ، وأضف المخزن المؤقت للإنزيم المقابل. احتضان العينة عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لهضم بوابات المفصل. بعد ذلك ، قم بهضم بوابات الشوكة عن طريق إضافة ثماني وحدات من إنزيم التقطيع NT BST mb واحد لكل ميكروغرام واحد من البلازميد والمخزن المؤقت للإنزيم المقابل.

احتضان العينة عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لإعداد مراسلي الفلورسنت أولا Resus ، قم بتعليق العينات وتحديدها كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. ثم امزج 10 ميكرولترات من الخيط السفلي للمراسلين مع 13 ميكرولترا من خيط التبريد العلوي في عازلة EDTA من أسيتات ثلاثية مع 12.5 ملليمولار من المغنيسيوم.

لضمان إخماد جميع النباتات ، يتم إخماد أربعة خيوط مصنفة ، يجب إضافة 30٪ من الخيط المسمى المروي. بعد ذلك ، قم بإجراء مجمع المراسل C باستخدام جهاز تدوير حراري. قم بتبريد العينة من 95 درجة مئوية إلى 20 درجة مئوية بمعدل درجة مئوية واحدة في الدقيقة.

عند الانتهاء ، قم بتخزين العينة عند أربع درجات مئوية بعد المعايرة. ابدأ قياسات التألق عن طريق ضبط وحدة التحكم في درجة الحرارة أولا على 25 درجة مئوية بينما تستقر درجة الحرارة. قم بإعداد المعلمات المناسبة لقياسات الحركية في برنامج الحصول على البيانات.

بعد فتح البرنامج الخاص بمقياس الفلور الطيفي ، اضبط عرض الانزلاق على 2.73 نانومتر لكل من الإثارة والانبعاث أحادي اللون. ثم اضبط وقت التكامل على 10 ثوان لكل نقطة زمنية 62 واضبط إجمالي وقت القياس على 24 ساعة. أخيرا ، اضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث لتتناسب مع غابة النباتات المستخدمة في التجربة.

بعد ذلك ، أضف 410.2 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز و 52.8 ميكرولتر من 10 إضافات من أسيتات EDTA تحتوي على 125 ملليمولار من المغنيسيوم إلى خلية كوارتز اصطناعية. أضف أيضا ميكرولترين من خيوط بولي T سعة 300 مللي مولار ، ثم قم بتدوير خلية الكوارتز الاصطناعية لمدة 10 إلى 15 ثانية. بعد ذلك ، عند تسعة ميكرولتر من خيوط المراسل عند 10 ميكرومولار وستة ميكرولترات من كل خصلة مساعدة عند 10 ميكرومولار.

ثم عند 45 ميكرولترا من كل من بوابات الوصلة والشوكة عند ميكرومولار واحد واخلط المحلول برفق عن طريق سحب ماصته لأعلى ولأسفل 20 مرة على الأقل. أخيرا ، عند تسعة ميكرولتر من 10٪ صوديوم ، قم بعمل كبريتات الأقنية لتحقيق تركيز نهائي قدره 0.15٪ SDS ، امزج التفاعل برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 20 مرة على الأقل ، ضع خلايا الكوارت الاصطناعية على الفور في غرفة طيف الفلوتر وابدأ في قياس الحركية. بعد خمس دقائق من القياس ، أضف ثلاثة ميكرولترات من خيوط الإدخال.

أضف 10 ميكرومولار إلى خلية ربع جالون الاصطناعية. أثناء إيقاف برنامج الحصول على البيانات مؤقتا ، امزج التفاعل برفق عن طريق ماصته لأعلى ولأسفل 20 مرة على الأقل ، ثم أغلق غطاء الضوء واستمر في تسجيل حركية التفاعل حتى يصل إلى ثبات. تظهر بيانات حركية الحالة للبوابات المشتقة من البلازما والبوابات المركبة هنا في التجارب.

تثبيت تركيز خيط الإشارة A بينما يتنوع مقدار الإشارة التحفيزية B. تستخدم الإشارة C لقراءة تقدم التفاعل دون مقاطعة. يعرف دوران الدورة الحفازة بأنه مقدار الإشارة C الناتجة لكل عامل حفاز B في وقت معين.

للحصول على نظام تحفيزي مثالي ، يجب أن يزداد رقم الدوران هذا خطيا بمرور الوقت وأن يكون مستقلا عن كمية المحفز طالما أن الركيزة غير محدودة. هنا لوحظ أن النظام المركب ينحرف عن الزيادة الخطية المثالية للدوران في وقت أبكر بكثير مما يفعله النظام المشتق من البلازما ، مما يشير إلى عزل المحفز من خلال تفاعل جانبي غير مرغوب فيه. تتم مقارنة تسرب الدائرة لكل من البوابات المشتقة من البلازما والبوابات المركبة هنا ، ويلاحظ أن نسبة إشارة التسرب باستخدام البوابات المشتقة من البلازما أقل بحوالي 8٪ من تلك المستخدمة باستخدام البوابات المركبة بعد 10 ساعات من التفاعل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء بوابات DNA قوية من البلازميد البكتيري واختبار البوابات باستخدام قياسات حركية الفلورة.