جيل من البلازميد ناقلات معربا عن بروتينات الموسومة FLAG تحت تنظيم الاستطالة الإنسان عامل-1α المروج عن طريق الجمعية جيبسون

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام نهج تجميع جيبسون لإنشاء تركيبات حمض نووي كبيرة ومعقدة تجمع بين الأجزاء القصيرة والطويلة من عدة مصادر مختلفة للحمض النووي. أولا ، قم بتصميم تسلسل النيوكليوتيدات الكامل للبلازميدات حسابيا ثم تصميم مجموعات أولية متداخلة. بعد ذلك يتم تضخيم قوالب الحمض النووي لتفاعل التجميع بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

بعد ذلك ، يتم إجراء تنقية منتجات PCR. الخطوة الأخيرة هي تحويل تفاعل التجميع للبلازميدات الناتجة والتحقق من استنساخ البلازميد. في النهاية ، يتم استخدام تفاعل تجميع جيبسون لتطوير البلازميدات المتوازية التي تحتوي على إصدارات ذات علامات علم من النوع البري وبروتينات CSTF 64 الطافرة تحت تنظيم النسخ لعامل الاستطالة البشري واحد محفز ألفا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الحمض النووي التقليدي Corning ، هي أنها يمكن أن تخلق بالتوازي ، متشابهة في التصميم ، والنوع البري ، وبلازميدات متحولة دون خطوات Corning المتسلسلة. تصميم تسلسل مستمر للنيوكليوتيدات لتمثيل البلازميد النهائي. الآن قم بإدراج البلازميدات الفعلية وشظايا الحمض النووي التي سيتم استخدامها كقوالب في شظايا الحمض النووي بترتيب PCR غير المتوفرة بسهولة ، مثل مجموعات مختلفة من العلامات والمحفزات كأجزاء DNA اصطناعية مفردة أو متعددة.

بعد ذلك ، قسم تسلسل النيوكليوتيدات المستمر للبناء النهائي إلى شظايا DNA مناسبة ل PCR. تأكد من أن الشظايا تتطابق مع البلازميدات المتاحة وشظايا الحمض النووي الاصطناعية. تجنب شظايا الحمض النووي الأصغر من 200 نيوكليوتيد.

بجوار الوصول إلى أداة إنشاء التمهيدي، حدد قائمة تعيين التفضيلات في النافذة المنبثقة تغيير إعدادات تجميع Gibson. حدد علامة التبويب تغيير pres ، ثم حدد قائمة إنشاء البناء لإدراج أجزاء DNA المنقسمة في أداة إنشاء التمهيدي بالتتابع من الخمسة الأولية إلى النهاية الأولية الثلاثة. افتح نافذة الإدخال المتجه أو إدراج جزء ، والصق أول جزء من الحمض النووي يمثل الطرف الخمسة للحمض النووي المتجه بتنسيق A سريع وقم بتسمية جزء الحمض النووي هذا.

اختر الطريقة المناسبة للحصول على جزء الحمض النووي. ثم انقر فوق علامة التبويب متابعة. إذا كانت هناك حاجة لإضافة نيوكليوتيدات إضافية أو مواقع تقييد عند تقاطع البناء النهائي ، فافتح جزء الإضافة والإدراج في نافذة التجميع في مناطق فاصل التمهيدي الأمامي أو العكسي.

أدخل النيوكليوتيدات الإضافية أو مواقع التقييد في جزء واحد فقط من أجزاء الحمض النووي. ثم انقر فوق علامة التبويب تم. كرر لجميع الأجزاء حتى يكتمل البناء.

حدد قائمة التمهيدي للعرض وراجع تسلسلات التمهيدي. كرر أيضا لجميع التركيبات ، المتجهات ، العمود الفقري والإدخالات أو لأجزاء الحمض النووي المختلفة. خفف بادئات PCR إلى 10 ميكرومولار في الماء أو te buffer.

ثم قم بتخفيف جميع قوالب الحمض النووي والحمض النووي الاصطناعي أحادي الجداول لتفاعل البوليميراز المتسلسل إلى نانوجرام واحد لكل ميكرولتر في الماء. قم بتجميع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في درجة حرارة الغرفة عن طريق الجمع بين 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومولار من كل برايمر. ميكرولتر واحد من نانوغرام واحد لكل ميكرولتر قالب جزء من الحمض النووي 25 ميكرولتر من الساخن.

ابدأ في التدقيق اللغوي لبوليميراز الحمض النووي و 19 ميكرولترا من الماء. امزج الأنبوب عن طريق النقر برفق واجمع قطرات السائل عن طريق الطرد المركزي القصير. تضخيم في وقت واحد في أنابيب منفصلة ، شظايا الحمض النووي ذات الحجم المماثل وفقا للتوصيات الخاصة ببوليميراز الحمض النووي المستخدمة.

قم بإجراء 25 إلى 28 دورة PCR أو تحديد عدد الدورات التي تنتج إنتاجية كافية من الحمض النووي. قم بحل خمسة ميكرولترات من تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام AROS القياسي. تحقق من ظهور نطاق DNA واحد يمثل منتج PCR.

حدد الحجم والكمية النسبية لشظايا الحمض النووي باستخدام معايير الوزن الجزيئي للحمض النووي إذا لزم الأمر ، كرر تفاعل البوليميراز المتسلسل للحصول على كمية كافية من شظايا الحمض النووي. انقل PCRs المهضومة مسبقا باستخدام أنابيب DPN واحدة إلى 1.5 ملليلتر وأضف 81 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي لتنقية الحمض النووي إلى كل أنبوب. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

ضع الأنابيب على المجمع المغناطيسي لمدة دقيقتين. الآن ، تخلص من السائل الصافي. يغسل مرتين ب 200 ميكرولتر من 80٪ إيثانول لمدة 30 ثانية.

ثم أعد تعليق الخرزات المجففة في 10 ميكرولتر من 10 ملليمولار تريس هيدروكلوريد درجة الحموضة 8.0 بعد دقيقتين ، قم بالدوران لفترة وجيزة ثم ضع الأنابيب على المجمع المغناطيسي لمدة دقيقتين. قم بإزالة 8.5 إلى 10 ميكرولتر من المحلول الشفاف وضعه في أنبوب جديد مسمى مسبقا. تحديد تركيز شظايا الحمض النووي عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية.

استخدم ما لا يقل عن 100 نانوجرام من جزء الحمض النووي الذي يمثل العمود الفقري للناقل أو جزء الحمض النووي الذي يحمل العلامة الانتقائية. احسب الفائض المولي الثلاثي لشظايا الحمض النووي التي سيتم استخدامها كإدخالات. امزج الكميات المحسوبة من شظايا الحمض النووي في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

ثم اضبط مستوى الصوت على 10 ميكرولتر. أضف 10 ميكرولتر من مزيج تجميع جيبسون الرئيسي. احتضان التفاعل عند 50 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري PCR.

المضي قدما في تحويل منتج التجميع غير الكفء ه القولوني ، أو تجميد المنتجات عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لحين الحاجة. اتبع إجراء التحويل المصاحب للخلايا الكيميائية أو الكهربائية المختصة. عادة ما تستخدم ميكرولترين من تفاعل التجميع لكل تفاعل تحويل.

أخيرا ، تأكد من نجاح استنساخ الحمض النووي عن طريق تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات محددة أو قياسية. تحليل بيانات التسلسل للتأكد من دقتها. تم تصميم هذه التجربة لاستنساخ بروتين عامل تحفيز الانقسام 64 وكذلك CSTF 64 المتحور.

دمج البروتينات في علامة علم ثلاثة x تحت التنظيم التعبيري لمروج ألفا HE F1. لم يكن لدينا بلازميد يحتوي على HE F1 alpha متبوعا بعلامة العلم ثلاثة x. ومع ذلك ، كانت البلازميدات التالية متاحة.

PC DNA 3.1 M همسة HF واحد ألفا يحتوي على البلازميد والفأر CSTF 64 البلازميدات. تم تجميع التسلسل الكامل للبناء باستخدام تطبيقات تحرير النيوكليوتيدات والنصوص. بعد ذلك ، تم تقسيم التسلسل إلى أربع قطع ملائمة تتوافق مع الحمض النووي البلازميد المتاح.

تم تضخيم شظايا الحمض النووي الأربعة لتفاعلات التجميع بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تم تضخيم البلازميدات الناتجة من المستنسخة الفردية وتحليلها عن طريق هضم إنزيم التقييد للتجميع الصحيح في ناقل الحمض النووي للكمبيوتر الشخصي ، ثم تم التحقق من المستنسخة المختارة عن طريق التسلسل. بمجرد إتقان تقنية التجميع ، بما في ذلك البلازميد والتصميم الأساسي ، يمكن إجراء التحقق من تفاعل البوليميراز المتسلسل والاتصالات اللاحق في غضون خمسة أيام ، باستثناء وقت تخليق الحمض النووي الأولي والاصطناعي وتسليمه.