كشف حساسية Proteopathic البذر آخر مع الحنق التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن نشاط البذر المرضي البروتيو من مصادر مؤتلفة أو بيولوجية ، مما يتيح الكشف الحساس عن البروتين والركام والعينة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التنكس العصبي. على سبيل المثال ، كيف يمكننا تقييم التغيرات في نشاط البذر كميا بعد التدخل العلاجي في النماذج الحيوانية للأمراض؟

تشمل مزايا هذه التقنية خصوصيتها العالية تجاه المستويات المنخفضة من مجاميع البروتين. خصوصيته الرائعة وسهولة استخدامه وإنتاجيته العالية. سأعرض هذا الإجراء اليوم أنا ، جنبا إلى جنب مع المؤلف المشارك براندون هولمز.

لتحضير مادة البذور البيولوجية ، ابدأ بوزن أنسجة المخ المجمدة في قارب مصل اللبن القابل للتصرف ثم انقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي الشكل ، وأضف مخزن تجانس الجليد البارد ، بحيث يكون الحل النهائي 10٪ لانتظار الحجم ونقل العينات إلى غرفة باردة على الجليد. بعد ذلك ، اضبط مؤشر المسبار على الإعدادات المناسبة واشطفه جانبا وأسفل المسبار.

لذا قم بتمرير طرف المؤشر ثلاث مرات كما هو موضح ، مع مسح المسبار بين كل محلول. عندما يكون المسبار جاهزا ، اغمر الطرف في مخزن التجانس لعينة واحدة وابدأ الصوتنة بتوصيل 25 نبضة إجمالية. عندما يكون النسيج في حالة تعليق تماما ، قم بتدوير المتجانس ونقل السوبينات إلى أنبوب نظيف.

الحرص على عدم إزعاج الحنك. في حين أن العديد من تقنيات التجانس الأخرى متوفرة ، فإن الاختبار متفوق على عزل كميات صغيرة من البذور المرضية البروتيو عن العينات البيولوجية. يتيح التفكك الميكانيكي تحطيرا متسقا وفعالا للأنسجة واستخراج البذور اللاحقة.

ثم قم بتقطيع المستلق وتخزين المحللات عند سالب 80 درجة مئوية. لإعادة تشغيل خلايا المستشعر الحيوي في ظل ظروف معقمة ، اشطف كل خط خلية باستخدام PBS دافئ متبوعا بحضانة لمدة ثلاث دقائق باستخدام التربسين EDTA. عندما تنفصل الخلايا ، أوقف التفاعل باستخدام وسط الثقافة الدافئة وانقل الخلايا على الفور إلى أنبوب مخروطي الشكل.

الطرد المركزي للخلايا resus ، مع تعليق الحبيبات في وسط جديد. ثم عد الخلايا وقم بعمل تخفيف خلية مزيج رئيسي من 3 ، 500 ، 000 خلية لكل 13 مل من الوسط. باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل ببطء 130 ميكرولترا من الخلايا إلى كل بئر من مزرعة الأنسجة ذات القاع المسطح 96 لوحة الآبار مع الحرص على وضع أطراف الماصة في وسط الآبار دون لمس قاع اللوحة.

بمجرد طلاء الخلايا ، اتركها تستقر دون إزعاج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم احتضن اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون وأكبر من أو تساوي 80٪ رطوبة نسبية. في اليوم التالي عندما تكون خلايا المستشعر الحيوي متقاربة بنسبة 60 إلى 65٪ ، اجمع بين الكاشف الشحمي المتوسط المختزل في الدم ، ومصدر البذور البيولوجي لعمل مجمعات التنبيغ. ثم قم بتقطيع 20 ميكرولترا من مركب التنبيغ أسفل جانب كل بئر مستشعر حيوي فردي وأعد الخلايا المعالجة إلى الحاضنة لمدة 24 إلى 48 ساعة أخرى قبل الحصاد.

ستظهر الخلايا غير المعالجة مضان منتشر فقط. ومع ذلك ، ستظهر الخلايا المعالجة بمادة بذور تاو مجاميعا ساطعة بعد يوم إلى يومين لحصاد الخلايا ، استبدل وسط زراعة الخلايا ب 50 ميكرولتر من tryin EDTA ، مما يوقف التفاعل. بعد خمس دقائق مع 150 ميكرولتر من الثقافة المبردة ، متوسطة ، انقل الخلايا على الفور إلى صفيحة سفلية مستديرة 96 جيدا وحبيبات الخلايا ، واستنشق المواد الطافية S دون إزعاج الكريات ، ثم قم بإعادة التشكيل برفق ولكن تماما ، الخلايا في 50 ميكرولتر من 2٪ بارالديهايد لمدة 10 دقائق.

ثم قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي المبرد في أسرع وقت ممكن. بعد التثبيت ، قم بتحميل اللوحة على مقياس تدفق خلوي متوافق مع الحنق وقم بإنشاء منطقة تشتت جانبية مقابل منطقة تشتت أمامية بواسطة مخطط متغير. بعد ذلك ، مع تشغيل خط الخلية الأول ، اضبط الفولتية المبعثرة الجانبية والمشتتت الأمامي حتى يصبح عدد الخلايا في الربع الأيسر السفلي.

ثم باستخدام أداة المضلع ، حدد مجموعة الخلايا على أنها مشية P واحد. الآن قم بعمل ارتفاع مبعثر أمامي مقابل منطقة التشتت الأمامية حسب مخطط متغير وقم بتطبيق البوابة P الأولى. بعد ذلك ، حدد الخلايا المفردة على أنها مشية P اثنين وقم بإنشاء رسم بياني واحد لكل منهما.

بالنسبة لمرشحات C-F-P-Y-F-P والحنق ، قم بتطبيق البوابة P من اثنين إلى ثلاثة رسوم بيانية مختلفة ، واحدة لكل من مرشحات C-F-P-Y-F-P ومرشحات الحنق للتعويض. ارتفاع في 30 ميكرولتر من خط الخلية تعليق واحد إلى 200 ميكرولتر من خط الخلية تعليق اثنين. ثم انقر فوق أيقونة إعدادات الأداة متبوعة بعلامة تبويب التعويض والتحقق من المصفوفة لفتح جدول التعويض.

قم بإنشاء منطقة الحنق مقابل منطقة CFP عن طريق مخطط متغير وتطبيق البوابة P اثنين. ثم مع تشغيل خط الخلية الأول وخط الخلية الثاني ، انقر فوق رمز الربع وارسم أرباعا مثل الفلورسنت يتم فصل المجموعات السالبة والموجبة بواسطة الربعين السفليين. الآن قم بإنشاء جدول إحصائيات يعرض متوسط شدة التألق أو MFI للفرت للبوابات الثلاث LL three و LR واضبط معلمة الحنق في مصفوفة التعويض حتى يصبح MFI لإشارة الحنق متساويا تقريبا بين LL ثلاثة و LR ثلاثة.

بعد ذلك ، قم بعمل منطقة YFP مقابل منطقة CFP عن طريق مخطط متغير مع أرباع. اضبط معلمة YFP في مصفوفة التعويض حتى تصبح MFI لإشارة YFP متساوية تقريبا بين الأرباع. على غرار ما هو موضح سابقا لقياس تدفق الحنق الخلوي.

يحدث الامتداد الفلوري الأولي من CFP المنبعث في قناة الكشف عن الحنق ، والذي يمكن تصحيحه عن طريق تعويض التألق باستخدام خلايا التحكم الموجبة أحادية اللون عندما يتم ضبط جميع البوابات وتعويض إشارة CFP. قم بتمييز الآبار ذات الأهمية وقم بتشغيل ما تبقى من اللوحة لتحليل البيانات. أولا، حدد الخلايا والخلايا المفردة باستخدام نفس المعلمات التي نقوم بإعداد تحليل التدفق.

بعد ذلك ، باستخدام خط الخلية الثالث ، ارسم الخلايا الموجبة المفردة YFP في حنق مقابل YFP بواسطة مخطط متغير. ارسم بوابة متعددة الأضلاع تمتد على طول وبعيدا عن منحدر مجموعة الخلايا الموجبة للحنق لتحديد مشية الحنق الكاذبة ، والتي تستبعد امتداد YFP إلى مرشح الحنق. بعد تطبيق مشية الحنق الكاذب على جميع العينات ، ارسم الخلايا الشحمية الفارغة المعالجة C-F-P-Y-F-P على الحنق مقابل CFP عن طريق مخطط متغير وأدخل GA متعدد الأضلاع على طول منحدر السكان الذي يمتد لأعلى ويسارا بعيدا عن السكان.

تعتبر أي أحداث تتحول إلى هذه البوابة إيجابية للقلق وسترتبط النسبة المئوية للخلايا بعيار البذور المستخدم أثناء العلاج. أخيرا ، سجل معلمات التحليل ذات الأهمية ، بما في ذلك النسبة المئوية لإيجابية الحنق ومتوسط شدة التألق للخلايا الإيجابية للحنق. ثم قم بقياس ناتج النسبة المئوية للإيجابية و MFI لحساب كثافة الحنق المتكاملة يدويا.

في حالة عدم وجود مجاميع أو بذور تاو ، يتم الحفاظ على تاو في حالة أحادية قابلة للذوبان كما تتمثل في إشارة فلورية سالبة منتشرة وسلبية متسقة. بعد إدخال بذور تاو في خلايا المستشعر الحيوي ، يتم تحويل تاو الداخلي إلى تقدير كمي للحالة المجمعة والإيجابية. يؤكد تحليل قياس التدفق الخلوي التالي أن تركيزات المولار الفيمتو من تاو المؤتلف كافية للكشف. هنا.

تعمل أنسجة جذع الدماغ من فئران tauopathy التي تم التضحية بها في أعمار مختلفة كمنطقة دماغية تمثيلية تظهر اكتشافا ثابتا لنشاط البذر عبر في وقت مبكر من عمر 1.5 شهر. في هذه التجربة ، أظهر الدماغ المتجانس من الأشخاص الذين يعانون من مرض الزهايمر نشاطا قويا في البذر ، في حين أن الأشخاص الذين تطابقوا مع العمر ولم يثبت الأشخاص الذين يعانون من مرض هنتنغتون خصوصية الفحص لمجاميع تاو الثقافات العصبية الأولية غير المعالجة المنقولة مع تاو و CFP و tau. أظهرت تركيبات الفيروسات العدسية YFP إشارة فلورية منتشرة عند المعالجة ببذور تاو المؤتلفة.

ومع ذلك ، فإن تاو الذاتية تشكل مجاميع كبيرة يمكن اكتشافها عن طريق قياس تدفق الحنق الخلوي حتى في حالة عدم وجود التنبيغ بوساطة الجسيمات الشحمية. عندما يتم تحضين مصادر البذور مسبقا بالأدوية التي تمنع امتصاص تاو مثل الهيبارين ويتم معالجتها في حالة عدم وجود الجسيمات الشحمية ، يمكن حظر نشاط البذر الموجود في كل من عينات دماغ الفأر المؤتلف وعينات الفئران التاوباثي. بمجرد إتقانها.

يمكن إكمال هذه التقنية في ثلاثة أيام مع كل يوم من ساعة إلى ساعتين فقط من العمل على مقاعد البدلاء. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن التحسين الداخلي سيكون مطلوبا لخطوات معينة. على سبيل المثال ، عند تحديد العيارات الفعالة من البذور المرضية البروتيو من مصادر بيولوجية مختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد وتشغيل وتحليل تجارب قياس التدفق الخلوي للحنق لأغراض الكشف عن نشاط البذر المرضي البروتيو من المصادر المؤتلفة والبيولوجية.