كشف حساسية Proteopathic البذر آخر مع الحنق التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن نشاط البذر البروتيني المرضي من مصادر مؤتلفة أو بيولوجية، مما يتيح الكشف الحساس عن البروتينات والتجمعات في عينة ما. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال التنكس العصبي. على سبيل المثال، كيف يمكننا تقييم التغيرات في نشاط البذر كمياً بعد التدخل العلاجي في النماذج الحيوانية للمرض؟

تشمل مزايا هذه التقنية خصوصيتها العالية تجاه المستويات المنخفضة من تجمعات البروتين، ودقتها الفائقة، وسهولة استخدامها، وإنتاجيتها العالية. سأقوم اليوم باستعراض هذا الإجراء برفقة المؤلف المشارك Brandon Holmes.

لتحضير المادة البذرية البيولوجية، ابدأ بوزن أنسجة الدماغ المجمدة في وعاء وزن بلاستيكي مخصص للاستخدام مرة واحدة. بعد ذلك، انقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي، وأضف محلول التجانُس المبرد بالثلج، بحيث يكون التركيز النهائي للمحلول 10% حجمياً، ثم انقل العينات إلى غرفة باردة فوق الثلج. بعد ذلك، اضبط المجس وفقاً للإعدادات المناسبة واشطف جانب وقاع المجس.

اغمس رأس المسبار ثلاث مرات كما هو موضح، مع مسح المسبار بين كل محلول والآخر. وعندما يصبح المسبار جاهزاً، اغمر الرأس في محلول التجانُس (homogenization buffer) لعينة واحدة وابدأ عملية السونكة (sonication) بحيث يتم إرسال 25 نبضة إجمالاً. وبمجرد تعليق النسيج بالكامل، قم بطرد متجانس العينة مركزياً (spin down) وانقل الطافي (supernatant) إلى أنبوب نظيف.

مع الحرص على عدم إزعاج الحنك. وبينما تتوفر العديد من تقنيات التجانس الأخرى، فإن عملية التفكيك تعد الأفضل لعزل كميات صغيرة من بذور البروتينات المرضية من العينات البيولوجية. حيث يتيح التفكيك الميكانيكي تكسيراً متسقاً وفعالاً للأنسجة، وما يتبع ذلك من استخلاص للبذور.

بعد ذلك، يتم تقسيم السائل الطافي إلى حصص متساوية وتخزين المحللات عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. ولإعادة استزراع خلايا المستشعر الحيوي تحت ظروف معقمة، يتم شطف كل سلالة خلوية بمحلول PBS دافئ، يليه تحضين لمدة ثلاث دقائق مع trypsin EDTA. وعندما تنفصل الخلايا، يتم إيقاف التفاعل باستخدام وسط استزراع دافئ ونقل الخلايا فوراً إلى أنبوب مخروطي.

قم بطرد الخلايا المعاد تعليقها مركزياً، مع تعليق الراسب في وسط غذائي جديد. بعد ذلك، قم بعدّ الخلايا وتحضير مزيج رئيسي من تخفيف الخلايا بمعدل 3,500,000 خلية لكل 13 milliliters من الوسط الغذائي. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل ببطء 130 microliters من الخلايا إلى كل بئر من آبار لوحة زراعة الأنسجة ذات القاع المسطح المكونة من 96 بئراً، مع الحرص على وضع رؤوس الماصة في مركز الآبار دون لمس قاع اللوحة.

بمجرد توزيع الخلايا في الأطباق، اتركها لتستقر دون تحريك لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بتحضين الطبق طوال الليل عند 37 °C، و5% carbon dioxide، ورطوبة نسبية أكبر من أو تساوي 80%. في اليوم التالي عندما تصل درجة تلاحم خلايا المستشعر الحيوي إلى 60 إلى 65%، اخلط الوسط ذو المصل المخفض وكاشف الليبوزوم ومصدر البذور البيولوجية لتحضير معقدات التنقيل. بعد ذلك، استخدم الماصة لنقل 20 µL من معقد التنقيل على جانب كل بئر من آبار المستشعر الحيوي الفردية، وأعد الخلايا المعالجة إلى المحضنة لمدة 24 إلى 48 ساعة أخرى قبل عملية الحصاد.

ستظهر الخلايا غير المعالجة فقط فلورية منتشرة. ومع ذلك، ستظهر الخلايا المعالجة بمواد بذور tau تجمعات ساطعة. بعد مرور يوم إلى يومين، ولحصد الخلايا، استبدل وسط زراعة الخلايا بـ 50 microliters من tryin EDTA لإيقاف التفاعل. بعد خمس دقائق مع 150 microliters من وسط زراعة مبرد، انقل الخلايا فوراً إلى طبق بـ 96 well ذو قاع مستدير وقم بترسيب الخلايا، ثم اسحب السوائل الطافية دون تعكير الرواسب، وبعد ذلك أعد تعليق الخلايا بلطف وبدقة في 50 microliters من 2%paraldehyde لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى وأعد تعليق الرواسب في 200 µL من منظم تدفق الخلايا المبرد في أسرع وقت ممكن. وبعد التثبيت، قم بتحميل اللوحة على جهاز قياس التدفق الخلوي المتوافق مع fret، وأنشئ مخططاً يوضح مساحة التشتت الجانبي مقابل مساحة التشتت الأمامي حسب المتغير. بعد ذلك، ومع تشغيل الخط الخلوي الأول، اضبط جهود التشتت الجانبي والتشتت الأمامي حتى تصبح مجموعة الخلايا في الربع السفلي الأيسر.

ثم باستخدام أداة المضلع، حدد مجموعة الخلايا كبوابة P1. الآن قم بعمل مخطط تباين بين ارتفاع التشتت الأمامي ومساحة التشتت الأمامي وقم بتطبيق بوابة P1. بعد ذلك، حدد الخلايا المفردة كبوابة P2 وقم بإنشاء مدرج تكراري واحد لكل منها.

بالنسبة لمرشحات C-F-P-Y-F-P وfret، قم بتطبيق البوابة P على مخططين تكراريين مختلفين، واحد لكل من مرشحي C-F-P-Y-F-P وfret لغرض التعويض. أضف 30 µL من معلق الخط الخلوي one إلى 200 µL من معلق الخط الخلوي two. بعد ذلك، انقر على أيقونة إعدادات الجهاز ثم علامة تبويب التعويض وحدد خيار matrix لفتح جدول التعويض.

أنشئ مخططاً بيانياً يمثل مساحة fret مقابل مساحة CFP حسب المتغيرات، ثم طبق البوابة P two. وبعد تشغيل الخط الخلوي cell line one والخط الخلوي cell line two، انقر على أيقونة الربع وارسم أرباعاً بحيث يتم فصل المجموعات الفلورية السالبة والموجبة بواسطة الربعين السفليين. الآن، أنشئ جدول إحصائيات يعرض متوسط شدة الفلورة أو MFI لـ fret للبوابات LL three و LR three، واضبط معامل fret في مصفوفة التعويض حتى يصبح MFI لإشارة fret متساوياً تقريباً بين LL three و LR three.

بعد ذلك، قم بإنشاء مخطط مبعثر للمساحة الخاصة بـ YFP مقابل المساحة الخاصة بـ CFP مع تحديد الأرباع. قم بتعديل معامل YFP في مصفوفة التعويض حتى تصبح شدة الفلورة المتوسطة (MFI) لإشارة YFP متساوية تقريبًا بين الأرباع، على غرار ما تم توضيحه سابقاً في قياس التدفق الخلوي لـ FRET.

يحدث التداخل الفلوري الأساسي نتيجة انبعاث CFP في قناة كشف FRET، وهو ما يمكن تصحيحه عبر التعويض الفلوري باستخدام خلايا التحكم الموجبة أحادية اللون. بمجرد ضبط جميع البوابات وتعويض إشارة CFP، قم بتحديد الآبار ذات الصلة وتشغيل بقية الطبق لتحليل البيانات. أولاً، قم بتعريف الخلايا والخلايا المفردة باستخدام نفس المعايير التي نستخدمها في إعداد تحليل التدفق.

بعد ذلك، وباستخدام الخط الخلوي الثالث، قم بتمثيل الخلايا الموجبة لـ YFP فقط في مخطط توزيع fret مقابل YFP حسب المتغير. ارسم بوابة مضلعة تمتد على طول ومنحدر مجتمع الخلايا الموجبة لـ fret لتحديد بوابة fret كاذبة، والتي تستبعد تداخل YFP في مرشح fret. بعد تطبيق بوابة fret الكاذبة على جميع العينات، قم بتمثيل خلايا C-F-P-Y-F-P المعالجة بالليبوزومات الفارغة في مخطط توزيع fret مقابل CFP حسب المتغير، ثم ضع بوابة مضلعة على طول منحدر المجتمع تمتد للأعلى وإلى اليسار بعيداً عن المجتمع.

تُعتبر أي أحداث تنتقل إلى هذه البوابة موجبة لـ fret، وستتناسب نسبة الخلايا مع عيار البذور المستخدم أثناء المعالجة. وأخيرًا، قم بتسجيل معاملات التحليل ذات الصلة، بما في ذلك نسبة الإيجابية لـ fret ومتوسط كثافة الفلورة للخلايا الموجبة لـ fret. بعد ذلك، قم بحساب حاصل ضرب نسبة الإيجابية في MFI لحساب كثافة fret المتكاملة يدويًا.

في غياب تجمعات أو بذور بروتين tau، يظل tau في حالة أحادية قابلة للذوبان، وهو ما يظهر من خلال إشارة فلورية منتشرة ومتسقة وسلبية لتقنية fret. وبعد إدخال بذور tau في خلايا المستشعر الحيوي، يتحول tau الداخلي إلى حالة متجمعة وإيجابية لتقنية fret وفقاً لكمية fret. ويؤكد تحليل قياس التدفق الخلوي أن تركيزات الفيمتومولار من tau المؤتلف كافية للكشف هنا.

تُعد أنسجة جذع الدماغ المأخوذة من فئران مصابة باعتلالات تاو (tauopathy) والتي تم التضحية بها في أعمار مختلفة، منطقة دماغية تمثيلية تُظهر كشفاً مستمراً لنشاط البذر (seeding activity) عبر الحيوانات منذ عمر مبكر يصل إلى 1.5 شهر. وفي هذه التجربة، أظهر متجانس الدماغ المأخوذ من أشخاص مصابين بمرض ألزهايمر نشاط بذر قوياً، بينما لم تُظهر العينات الضابطة المتطابقة في العمر أو العينات المأخوذة من أشخاص مصابين بمرض هنتنغتون ذلك، مما يثبت خصوصية المقايسة لتجمعات بروتين تاو. وأظهرت المزارع العصبية الأولية غير المعالجة التي تم نقل بناءات فيروسية بطيئة (lentiviral constructs) لبروتينات tau و CFP و tau-YFP إليها، إشارة فلورية منتشرة عند معالجتها ببذور تاو مأشوبة.

ومع ذلك، يشكل بروتين tau الداخلي تجمعات كبيرة يمكن الكشف عنها بواسطة قياس التدفق الخلوي بتقنية fret حتى في حالة عدم وجود ترنسدكشن بوساطة الليبوزوم. وعندما يتم تحضين مصادر البذور مسبقاً مع أدوية تمنع امتصاص tau مثل الهيبارين وتُعالج في غياب الليبوزومات، يمكن تثبيط نشاط البذر الموجود في كل من عينات fis المؤتلفة وعينات دماغ الفئران المصابة باعتلال tau. بمجرد إتقان ذلك.

يمكن إتمام هذه التقنية في ثلاثة أيام، بحيث يتطلب كل يوم من ساعة إلى ساعتين فقط من العمل المخبري. عند تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن التحسين الداخلي سيكون مطلوباً لبعض الخطوات؛ على سبيل المثال، عند تحديد العيارات الفعالة للبذور الممرضة من مصادر بيولوجية متنوعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد وتشغيل وتحليل تجارب قياس التدفق الخلوي بتقنية FRET لأغراض الكشف عن نشاط البذر المسبب للأمراض من المصادر المؤتلفة والبيولوجية.