تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتحليل دوران الحويصلات خارج الخلوية في الدم باستخدام طريقتين مختلفتين. بالنسبة لطريقة الكشف عن الحويصلات خارج الخلوية الفردية، يتم أولاً عزل البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية أو PPP من عينة دم.

يتم بعد ذلك صبغ الـ PPP بالأجسام المضادة المقترنة بالفلوروكروم المطلوبة. أما بالنسبة لطريقة الكشف القائمة على الخرزات، فيتم تحضين الحويصلات خارج الخلوية مع الخرزات، ثم تُصبغ الحويصلات المرتبطة بالخرزات بالأجسام المضادة المقترنة بالفلوروكروم ذات الصلة. وفي النهاية، يمكن تحديد محتوى الحويصلات خارج الخلوية الدوارة عن طريق تحليل العينات باستخدام قياس التدفق الخلوي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المجهر الإلكتروني أو الفصل بالخرز المغناطيسي في أنها أسرع بكثير وتسمح بتقييم إجمالي مجموعة escal خارج الخلوية بدلاً من الاقتصار على مجموعات فرعية محددة. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأن نجاحها يتطلب التزاماً صارماً بالمناورات الموضحة ومعايير إعداد مقياس التدفق الخلوي، وذلك لإنتاج بيانات عالية الجودة وبأقل قدر من التباين اليومي. ابدأ بطرد عينات الدم الكامل مركزياً لفصل البلازما عن الطبقة الميضية والخلايا الحمراء. بعد ذلك، انقل أجزاء مقدارها 1.2 milliliter من طافي البلازما إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter، مع الحرص على عدم تعكير الطبقات السفلية التي تحتوي على الطبقة الميضية والخلايا الحمراء، ثم قم بطرد الطافي مركزياً مرة أخرى لإزالة أي صفيحات دموية أو شظايا خلوية كبيرة.

في نهاية عملية الطرد المركزي، انقل بعناية جميع عينات PPP باستثناء آخر 200 microliters إلى أنابيب جديدة، مع الحرص على عدم تعكير الرواسب. بعد ذلك، امزج البلازما عن طريق التقليب للأعلى والأسفل عدة مرات، وانقل 320 microliters من كل عينة إلى الصف العلوي من طبق 96 well plate. ولصبغ العينات، ادمج الأجسام المضادة المطلوبة لكل لوحة من اللوحات الثلاث في أنابيب ترشيح طاردة مركزية منفصلة بسعة zero point 22 micrometer، ثم قم بطرد الأجسام المضادة مركزياً باستخدام جهاز طرد مركزي أحادي السرعة وبزاوية ثابتة.

عند مرور كامل كمية الأجسام المضادة عبر المرشح، أضف الكمية المناسبة من الخليط إلى كل بئر من آبار الطبق ذي الـ 96 بئرًا كما هو موضح في الشكل. بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لمزج عينات PPP، ثم انقل 100 µL من كل عينة إلى الأجسام المضادة في الصف الثاني. ثم اخلط العينات مرة أخرى، وقم بتغيير الرؤوس وانقل 100 µL من العينة إلى كل صف من الصفين التاليين من الأجسام المضادة حسب الاقتضاء.

بالنسبة للتجربة، قم بتحضين الطبق عند درجة حرارة 4 °C بعد إضافة 220 µL من PBS لكل بئر في الصفوف من السادس إلى الثامن داخل كابينة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، وباستخدام ماصة متعددة القنوات قابلة لضبط العرض، انقل محتويات كل بئر إلى أنبوب الترشيح الطردي المقابل له دون تغيير الرؤوس.

استخدم 200 µL من محلول PBS من أحد صفوف الغسيل لشطف الآبار التي أُزيلت منها العينات للتو. بعد ذلك، انقل محلول الشطف إلى المرشحات نفسها التي أُضيفت إليها عينات PPP سابقاً، وأغلق المرشحات الطاردة مركزياً. وبمجرد نقل جميع عينات PPP المصبوغة مع محاليل الشطف الخاصة بها، قم بتدوير العينات في جهاز طرد مركزي ذو دوار ثابت.

بعد عملية الطرد المركزي، تأكد من عدم بقاء أي سائل فوق المرشحات. ثم أعد تعليق المكونات الموجودة أعلى المرشحات في 300 µL من PBS وانقل المحتويات المعاد تعليقها إلى أنابيب مُصنفة مسبقاً لإجراء تحليل التدفق الخلوي فوراً. إن غسل العينات المصبوغة باستخدام المرشحات الطاردة مركزياً يعزز الفصل بين إشارات الخلفية وإشارات العلامات الإيجابية.

ومن المهم ملاحظة أن بعض الحويصلات خارج الخلوية الأصغر حجماً، بما في ذلك الإكسوزومات، قد تُفقد عبر مسام المرشح. ولتحليل العينات، قم أولاً بضبط معلمات جهد التشتت الأمامي والجانبي على مقياس لوغاريتمي، واختر أدنى العتبات التي يسمح بها جهاز قياس التدفق الخلوي لكل معلمة. بعد ذلك، وأثناء تشغيل أنبوب من PBS المرشح بمرشح 0.22 µm، اضبط هذه الجهود عند أعلى القيم التي تستبعد غالبية ضوضاء الخلفية. بعد ذلك، قم بتشغيل أنبوب يحتوي على خليط من الخرز بحجم 1 µm أو أصغر، وارسم بوابة حول مجموعة الخرز في مخطط التشتت الأمامي مقابل الجانبي لالتقاط جميع الأحداث التي تقع تحت مستوى خرز 1 µm.

الآن، اضبط معدل التدفق في جهاز قياس التدفق الخلوي على الوضع المنخفض، واستخدم الخرزات لضبط قرص معدل التدفق في الجهاز للوصول إلى معدل الأحداث المطلوب. بعد ذلك، باستخدام أنبوب من الجسيمات الفلورية متعددة الألوان المخففة في PBS، قم برصد 5,000 حدث، مع تسجيل متوسط قيم الكثافة للتشتت الأمامي والتشتت الجانبي ولكل قناة لونية. بمجرد ضبط جميع المعلمات، قم بتشغيل كل عينة لمدة دقيقة أو دقيقتين بالضبط. بعد إتمام القراءة الأولى لكل أنبوب، اخلط 20 µL من 10% MP 40 في كل عينة، وأعد قراءة الأنابيب لنفس الفترة الزمنية للسماح بطرح الأحداث الإيجابية التي تم رصدها في العينة المحللة خلال فترة زمنية متساوية.

للكشف عن الحويصلات خارج الخلوية عن طريق الالتقاط القائم على الخرز، ابدأ بغسل خرز البوليسترين غير المطلي بحجم 6 µm مرتين باستخدام وسط RPMI، ثم أعد تعليقه في 2 mL من الوسط نفسه. بعد ذلك، أضف 6,000 خرزة إلى كل أنبوب fax جديد؛ حيث يوضع في أنبوب الضابط السلبي 400 µL من الوسط، وفي جميع الأنابيب الأخرى 200 µL من PPP أو الحويصلات خارج الخلوية المفصولة بالطرد المركزي الفائق حسب الاقتضاء، بالإضافة إلى 200 µL من الوسط. اضبط الحجم النهائي في كل أنبوب ليكون 400 µL.

بإضافة المزيد من الوسط الغذائي. تُحضن الأنابيب طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C على جهاز هزاز. وفي صباح اليوم التالي، تُغسل الخرزات بـ 2 mL من الوسط الغذائي.

قم بشفط السائل الطافي وحجب أي ارتباط غير نوعي باستخدام 400 µL من bovine serum albumin بتركيز 5%، ثم ضع الأنابيب على جهاز هزاز عند درجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث ساعات. وبعد مرور ثلاث ساعات، اغسل الخرزات في 2 mL إضافية من الوسط الغذائي وأعد تعليق الرواسب في 100 µL من وسط غذائي جديد. الآن قم بترشيح الأجسام المضادة وأضف الحجم المناسب من مزيج الأجسام المضادة المرشح إلى كل أنبوب، ثم بعد 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، اغسل الخرزات في 2 mL أخرى من الوسط الغذائي.

في هذه المرة، أعد تعليق الرواسب في 400 µL من الوسط الزراعي وقم بتحليل العينات فوراً بواسطة قياس التدفق الخلوي، مع ضبط معاملات التشتت الأمامي والجانبي عند أدنى عتبة يسمح بها جهاز قياس التدفق الخلوي كما تم توضيحه للتو. وأخيراً، قم بتحديد بوابة مجتمع الخرزات الفردية (singlet bead population) واجمع 2000 حدث لكل عينة. يمكن استخدام كل من طرق الكشف الفردية وتلك القائمة على الخرزات للكشف عن وجود الحويصلات خارج الخلوية في عينات PPP كما هو موضح في مخططات النقاط هذه. وبالنسبة لمقايسة الكشف الفردي، تُستخدم عينة الضبط المحللة (lysed control) لضبط البوابات للعينة المقابلة غير المدرجة.

يجب أن تقع غالبية الأحداث ضمن بوابة الحويصلات خارج الخلوية. على سبيل المثال، في هذا الشكل، أظهرت مخططات المعلمات الثنائية هذه الكشف عن العلامتين، CD 1 0 8 A و CD 2 35 A، وهما علامتان لكرات الدم الحمراء من المعروف أنهما يتواجدان معاً على الخلايا. وكما هو متوقع، فإن أكثر من نصف الأحداث الإيجابية في الحويصلات خارج الخلوية إيجابية لكلتا العلامتين، بينما في مخططات المعلمات الثنائية هذه، يظهر تعبير الحويصلات خارج الخلوية عن علامتين من المعروف أنهما لا تتواجدان معاً على الخلايا مجتمعات إيجابية منفصلة ومتميزة باستخدام طريقة الكشف المعتمدة على الخرز.

لا يوجد فصل بين المجموعات الموجبة والسالبة، وتظهر الأحداث في المربعات الموجبة المزدوجة، على الرغم من أنها لا توجد عادةً في نفس أنواع الخلايا، وذلك بسبب حقيقة أن كلا النوعين من الحويصلات خارج الخلية سيرتبطان بخرزة واحدة. لذلك، فإن أفضل طريقة لتحليل البيانات المستمدة من هذه الطريقة هي استخدام الرسوم البيانية التكرارية المتراكبة مع بيانات الضابط السالب، حيث يُلاحظ انزياح ظاهر في تعبير العلامة في العينات ذات الخرزات مقارنة بـالضوابط. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن استخدامها لتحليل 12 عينة دم باستخدام ثلاث مجموعات من الأجسام المضادة في غضون ثلاث إلى أربع ساعات باستخدام طريقة الكشف الفردية، أو في غضون يوم ونصف باستخدام طريقة الخرز إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الالتزام بالاتساق في معاملة كل عينة، والتأكد من ضبط معدل تدفق جهاز قياس التدفق الخلوي وشدة الفلورة بشكل صحيح في بداية كل تجربة لتتطابق مع إعدادات التجربة في اليوم السابق، خاصة عند تحليل عينات متعددة على مدار عدة أيام.