تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتحليل الدورة الدموية الحويصلة خارج الخلية في الدم بطريقتين مختلفتين. لطريقة الكشف عن الحويصلة الفردية خارج الخلية. يتم عزل البلازما الضعيفة الصفائح الدموية أو PPP أولا من عينة الدم.

ثم يتم تلطيخ PPP بالأجسام المضادة المترافقة الفلورية ذات الأهمية. بالنسبة لطريقة الكشف القائمة على الخرزة ، يتم تحضين الحويصلات خارج الخلية بالخرز ، ثم يتم تلطيخ الحويصلات المرتبطة بالخرزة بالأجسام المضادة المترافقة ذات الصلة بالفلوروكروم. في النهاية ، يمكن تحديد محتوى الحويصلة خارج الخلية المنتشرة عن طريق تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل المجهر الإلكتروني أو فصل الخرزة المغناطيسية ، هي أنها أسرع بكثير وتسمح بتقييم إجمالي عدد السكان خارج الخلية بدلا من أن تقتصر على مجموعات سكانية فرعية محددة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن نجاح هذه الطريقة يتطلب التزاما صارما بالمناورات المثبتة ومعلمات إعداد مقياس الخلايا من أجل إنتاج بيانات عالية الجودة مع الحد الأدنى من التباين اليومي ، ابدأ بالطرد المركزي لعينات الدم الكاملة لفصل البلازما عن طبقة بافي والخلايا الحمراء. بعد ذلك ، قم بنقل 1.2 مليلتر من المادة الطافية في البلازما إلى أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مليلتر ، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقات السفلية التي تحتوي على طبقة بافي والخلايا الحمراء ثم طرد المادة الطافية مرة أخرى لإزالة أي صفائح ضفائحية وشظايا خلايا كبيرة.

في نهاية الدوران ، انقل بعناية جميع عينات PPP باستثناء آخر 200 ميكرولتر من عينات PPP إلى أنابيب جديدة ، مع الحرص على عدم إزعاج الكريات. ثم امزج البلازما لأعلى ولأسفل عدة مرات وانقل 320 ميكرولترا من كل عينة إلى الصف العلوي من لوحة 96 بئر. لتلطيخ العينات ، اجمع الأجسام المضادة ذات الأهمية لكل لوحة من الألواح الثلاث في أنابيب مرشح فردية بحجم نقطة صفر 22 ميكرومتر ، وأنابيب مرشح طرد مركزي ، وقم بتدوير الأجسام المضادة باستخدام جهاز طرد مركزي أحادي السرعة بزاوية ثابتة.

عندما يمر كل الجسم المضاد عبر المرشح ، أضف الكمية المناسبة من الخليط إلى كل بئر من لوحة البئر 96 كما هو موضح في الشكل. بعد ذلك، استخدم ماصة متعددة القنوات لخلط عينات PPP ثم نقل 100 ميكرولتر من كل عينة إلى الأجسام المضادة في الصف الثاني. ثم امزج العينات مرة أخرى ، وقم بتغيير الأطراف ونقل 100 ميكرولتر من العينة إلى كل من الصفين التاليين من الأجسام المضادة حسب الاقتضاء.

للتجربة. احتضان اللوحة عند أربع درجات مئوية بعد 30 دقيقة عند 220 ميكرولتر من PBS لكل بئر إلى الصف من السادس إلى الثامن داخل خزانة السلامة البيولوجية. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات قابلة للتعديل بالعرض ، انقل محتويات كل بئر إلى أنبوب مرشح الطرد المركزي المقابل له دون تغيير الأطراف.

استخدم 200 ميكرولتر من PBS من أحد صفوف الغسيل لشطف الآبار التي تمت إزالة العينات منها للتو. ثم انقل محلول الشطف إلى نفس المرشحات التي تمت إضافة عينات PPP إليها مسبقا ، وأغلق مرشحات الطرد المركزي. بمجرد نقل جميع عينات PPP الملطخة مع محاليل الشطف الخاصة بها ، قم بتدوير العينات في جهاز طرد مركزي دوار ثابت.

بعد الدوران ، تأكد من عدم وجود سائل فوق المرشحات. ثم قم بتعليق قمم المرشحات في 300 ميكرولتر من PBS وانقل المحتويات المعلقة إلى أنابيب مسبقة التصنيف لتحليل التدفق الخلوي الفوري. غسل العينات الملطخة باستخدام مرشحات الطرد المركزي ، يعزز الفصل بين الخلفية وإشارات العلامة الإيجابية.

ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن بعض الحويصلات الأصغر خارج الخلية ، بما في ذلك الإكسوسومات ، قد تضيع من خلال أبواب المرشح لتحليل العينات ، أولا ، قم بتعيين معلمات جهد التشتت الأمامي والجانبي على مقياس سجل وحدد أدنى العتبات المسموح بها بواسطة مقياس الخلوي لكل معلمة. ثم أثناء تشغيل أنبوب من نقطة الصفر 22 ميكرومتر ، يقوم PBS المصفى بضبط هذه الفولتية على أعلى القيم التي تستبعد غالبية ضوضاء الخلفية. بعد ذلك ، قم بتشغيل أنبوب يحتوي على خليط من الخرز ، ميكرومتر واحد وأصغر ، وارسم بوابة حول مجموعة الخرزة في مخطط مبعثر أمامي جانبي لالتقاط جميع الأحداث تحت حبات ميكرومتر واحد.

الآن اضبط معدل تدفق مقاييس الخلايا على مستوى منخفض واستخدم الخرزات لضبط قرص معدل التدفق على مقياس الخلوي إلى معدل الحدث المطلوب. ثم باستخدام أنبوب من جزيئات الفلورسنت قوس قزح المخففة في PBS ، اكتساب 5 ، 000 حدث ، وتسجيل متوسط شدة القيم للتشتت الجانبي المبعثر الأمامي ، وكل قناة لونية. عند تعيين جميع المعلمات ، قم بتشغيل كل عينة لمدة دقيقة أو دقيقتين بالضبط بعد اكتمال القراءة الأولى لكل أنبوب ، امزج 20 ميكرولترا من 10٪ MP 40 في كل عينة ، وأعد قراءة الأنابيب لنفس القدر من الوقت للسماح بطرح الأحداث الإيجابية المكتشفة في العينة المحللة خلال فترة زمنية متساوية.

للكشف عن الحويصلات خارج الخلية عن طريق الالتقاط القائم على الخرزة ، ابدأ بغسل حبات البوليسترين غير المطلية بستة ميكرومتر مرتين باستخدام وسائط RPMI ، متبوعة ب Resus في ملليلترين من نفس الشيء. بعد ذلك ، أضف 6000 حبة إلى كل أنبوب فاكس جديد إلى أنبوب التحكم السالب عند 400 ميكرولتر من الوسائط إلى جميع الأنابيب الأخرى عند 200 ميكرولتر من PPP أو الحويصلات خارج الخلية لأجهزة الطرد المركزي الفائقة حسب الاقتضاء ، و 200 ميكرولتر من الوسائط. اضبط الحجم النهائي في كل أنبوب على 400 ميكرولتر.

مع المزيد من الوسائط. احتضان الأنابيب طوال الليل عند أربع درجات مئوية على شاكر. في صباح اليوم التالي ، اغسل الخرزات بملليلترين من الوسائط.

استنشق المادة الطافية ومنع أي ارتباط غير محدد ب 400 ميكرولتر من زلالات مصل البقر بنسبة 5٪ على شاكر عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد ثلاث ساعات ، اغسل الخرزات في ملليلترين آخرين من الوسائط وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من الوسط الطازج. الآن قم بتصفية الأجسام المضادة وإضافة الحجم المناسب من كوكتيل الأجسام المضادة المفلترة إلى كل أنبوب ، ثم بعد 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، اغسل الخرزات في ملليلترين آخرين من الوسائط.

هذه المرة قم بتعليق الكريات في 400 ميكرولتر من الوسائط وقم بتحليل العينات على الفور عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وضبط معلمات التشتت الداخلية الأمامية إلى أدنى عتبة يسمح بها مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح للتو. أخيرا ، قم بالحصول على مجموعة الخرزة المفردة واحصل على 2000 حدث لكل عينة. يمكن استخدام كل من طرق الكشف الفردية والقائمة على الخرزة للكشف عن وجود الحويصلات خارج الخلية في عينات PPP كما هو موضح في هذه المخططات النقطية بالنسبة لمقايسة الكشف الفردية ، يتم استخدام عنصر التحكم المحلل لتعيين البوابات للعينة غير المدرجة المقابلة.

يجب أن تقع غالبية الأحداث داخل بوابة الحويصلة خارج الخلية. على سبيل المثال ، في هذا الشكل ، أظهرت مخططات ثنائية المعلمة هذه اكتشاف العلامات ، CD 1 0 8 A و CD 2 35 A ، وهما علامتان لخلايا الدم الحمراء معروفتان بالتعايش على الخلايا. كما هو متوقع ، فإن أكثر من نصف الأحداث الإيجابية على الحويصلات خارج الخلية إيجابية لكلتا العلامتين ، بينما في هذه المخططات حسب المعلمات ، يظهر التعبير عن الحويصلة خارج الخلية لعلامتين معروفتين أنهما لا تتعايشان على الخلايا مجموعات موجبة منفصلة مميزة باستخدام طريقة الكشف القائمة على الخرزة.

لا يوجد فصل بين المجموعات السكانية الإيجابية والسلبية وتظهر الأحداث في الأرباع الموجبة المزدوجة ، على الرغم من أنها لا توجد عادة في نفس أنواع الخلايا نظرا لحقيقة أن كلا النوعين من الحويصلات خارج الخلية سوف ترتبط بحبة واحدة. لذلك ، من الأفضل تحليل البيانات من هذه الطريقة باستخدام الرسوم البيانية المتراكبة مع بيانات التحكم السلبية ، مع تحول واضح في تعبير العلامة الذي لوحظ في العينات المزينة بالخرز مقارنة بعناصر التحكم بمجرد إتقانها. يمكن استخدام هذه التقنية لتحليل 12 عينة دم بثلاث لوحات من الأجسام المضادة في ثلاث إلى أربع ساعات باستخدام طريقة الكشف الفردية أو في يوم ونصف بطريقة الخرزة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تكون متسقا في معالجة كل عينة ، وتأكد من ضبط معدل تدفق مقياس الخلايا وشدة الفلورسنت بشكل صحيح في بداية كل تجربة لتتناسب مع الإعدادات التجريبية لليوم السابق ، خاصة عند تشغيل عينات متعددة عبر عدة أيام.