القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسانباستخدام Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester
June 4th, 2019
يعرض هنا بروتوكول لقياس تكاثر خلايا CD4+ T استجابة للبروتينات المضادة للجينات أو الببتيدات باستخدام تخفيف الصبغة. هذا الفحص حساس بشكل خاص للخلايا T النادرة الخاصة بالمستضد ويمكن تعديله لتسهيل استنساخ الخلايا الخاصة بالمستضد.
يوفر هذا البروتوكول منصة لدراسة استجابات خلايا CD4T التي تكون ضعيفة في كثير من الأحيان ويصعب اكتشافها. يسمح هذا الأسلوب للكشف عن تعداد وعزل خلايا CD4T دون معرفة مسبقة فيما يتعلق بالعرض antigen. الميزة الرئيسية هي تحليل خلايا CD4T التي غالبا ما تكون مجموعات نادرة المرتبطة بالظروف المناعة الذاتية مثل مرض السكري من النوع الأول.
عند الحصول على عينة الدم المحيطية من متبرع سليم ، تمييع الدم في PBS بنسبة واحدة إلى اثنتين على الأقل قبل طبقات 35 ملليلتر من الدم أكثر من 15 ملليلتر من متوسط الكثافة الانحدارية في أنبوب 50 ملليلتر. فصل الخلايا بواسطة الطرد المركزي التدرج الكثافة وإزالة ما يقرب من 20 ملليلتر من طبقة البلازما العليا الناتجة. ثم جمع طبقة خلايا الدم البيضاء مع الحرص على تجنب بيليه خلية الدم الحمراء وغسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني جديد.
بعد العد، تمييع الخلايا إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا أحادية النوى الدموية الطرفية السادسة أو PBMC لكل ملليلتر من تركيز PBS. إضافة 300 ميكرولترات من الخلايا لكل عنصر تحكم في أنابيب 10 ملليلتر الفردية. بعد تتصدر كل أنبوب مع برنامج تلفزيوني، رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من تركيز RP5 المتوسطة.
ثم لوحة 100 ميكرولترات من الخلايا لكل عنصر تحكم إلى كل من ثلاثة آبار من 96 لوحة بئر تحتوي على 100 ميكرولترات من RP5 المتوسطة في البئر. ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة سبعة أيام. بعد ذلك، نقل PBMCs المتبقية إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر وإضافة ميكرولتر واحد من حل المخزون العامل CFSE لكل ملليلتر من تعليق الخلية إلى جانب الأنبوب.
عكس الأنبوب بسرعة عدة مرات لخلط الخلايا ووضعها في حاضنة ثقافة الخلية لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة ، قم باعتقال التفاعل مع خمسة ملليلترات من RP5 المتوسطة وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في مرة واحدة 10 إلى PBMCs السادسة لكل ملليلتر من RP5 المتوسطة الطازجة وإضافة ملليلتر واحد من الخلايا إلى أنبوب واحد 10 ملليلتر لكل مستضد ليتم اختبارها.
ثم إضافة 100 ميكرولترات من الخلايا لكل مستضد إلى كل من ثلاثة آبار من 96 بئر لوحة جيدا تحتوي على 100 ميكرولترات من RP5 المتوسطة تكملها مستضد مخفف من الفائدة في البئر. ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة سبعة أيام. لطخة مجموعات الخلايا CD4 + T لتحليل تدفق السيتوميترية، في نهاية الثقافة نقل كامل حجم الخلايا من كل بئر إلى الخلايا الفلورية تنشيط الفردية أو أنابيب FACS.
غسل كل عينة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تكملها 0.1٪ مصل العجل الجنين أو FCS. Resuspend الكريات في المضادة المضادة المضادة للدم البشري مناسبة في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني زائد FCS لكل أنبوب. احتضان الخلايا في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة، وغسل العينات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى FCS لكل أنبوب وإعادة تثبيت الكريات في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى FCS. مباشرة قبل التحليل، إضافة ميكرولتر واحد من يوديد بروبديسيوم إلى كل أنبوب للسماح باستبعاد الخلايا الميتة. بوابة الخلايا الليمفاوية وفقا لمناطقها إلى الأمام والجانبية مبعثر.
لاستبعاد الخلايا المبرمجة، بوابة منطقة التشتت الأمامية مقابل الخلايا السالبة لـ propidium iodide واستخدام الخلايا غير المُطَمَّعة لتعيين خط أساس جهد لخلايا غير فلورية. تعيين الفولتية لD4 الفلوروفور الأجسام المضادة وإشارة CFSE بحيث إشارة الفلورسنت هو أقل من 1000 لكل. استخدام التحكم اللون واحد CFSE وعينات CD4 لتأكيد إشارة الفلورسنت إيجابية لكل لون باستخدام الفولتية تعيين مع الخلايا غير الملطخة.
كما CFSE وأوديد بروبيديوم بعض التداخل الطيفي، وضبط التعويض لطرح الفلوري يوديد بروبديوم من الفلورسينسي CFSE حتى العينة فقط CFSE لا تسفر عن إشارة في قناة يوديد بروبديدوم. عندما تم تحليل كافة العينات، حساب مؤشر تقسيم الخلية عن طريق قسمة عدد الخلايا المقسمة على 5000 الخلايا غير المقسمة من مجموعة مستضد حفزها من قبل متوسط عدد الخلايا المقسمة لكل 5000 الخلايا غير المقسمة من الخلايا المستنم دون مستضد. تقريبا جميع المتبرعين تظهر قوية T-الخلية استجابة لتيتانوس toxoid بعد تحفيز في المختبر لأن المتبرعين قد تم تطعيم مما يجعل الكزاز توكوكسيد مكافحة إيجابية مفيدة.
ومع ذلك، فإن انتشار خلايا CD4+T من مراكز PBMCs غير المُحَرَّخة هو الحد الأدنى. بعد سبعة أيام من التحفيز مع الإنسان الموالية للأنسولين C-الببتيد, الموالية للأنسولين C-الببتيد محددة CD4 + T يمكن الكشف عن خلايا في الدم المحيطي للفرد مع نوع واحد من مرض السكري. PBMC حفز مع الأنفلونزا A بروتين مصفوفة الفيروس تثبت أيضا الانتشار.
معا، وهذه البيانات تثبت أن يمكن إجراء مقايسة باستخدام البروتينات طول كامل فضلا عن الببتيدات الاصطناعية قصيرة. يمكن تنفيذ مكون FACS من هذه الطريقة باستخدام جهاز قياس تدفق الخلايا لفرز الخلايا. باستخدام فارز خلية، يمكن عزل الخلايا التائية الخاصة بمضادات المضادات على مستوى الخلية المفردة لتحليل المصب.
وقد سمحت هذه الطريقة لاكتشاف استجابات الخلايا CD4T في الأفراد الذين يعانون من مرض السكري من النوع الأول في بداية مبكرة. تحليل هذه النادرة T-الخلية السكان باستخدام أساليب أخرى يطرح تحديات تقنية مختلفة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يوفر هذا البروتوكول طريقة حساسة لقياس الخلايا التائية CD4 + المتكاثرة استجابةً للبروتينات أو الببتيدات المضادة للمستضد. يسمح باكتشاف وعزلة الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد، وهو أمر حاسم لدراسة الحالات المناعية الذاتية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
- المناعة الذاتية
الخلفية
- تلعب الخلايا التائية CD4 + دورًا حاسمًا في الاستجابة المناعية.
- غالبًا ما يكون اكتشاف الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد تحديًا.
- يمكن تكييف هذا الاختبار لتقليد الخلايا التائية المحددة.
- إنه ذو أهمية خاصة لدراسة الأمراض المناعية الذاتية مثل داء السكري من النوع الأول.
غرض الدراسة
- لتطوير بروتوكول لقياس استجابات الخلايا التائية CD4 +.
- تسهيل اكتشاف مجموعات الخلايا التائية الضعيفة الخاصة بالمستضد.
- توفير طريقة لعزل هذه الخلايا لمزيد من الدراسة.
الطرق المستخدمة
- جمع عينة دم محيطي من المتبرعين الأصحاء.
- تخفيف الدم في PBS وطريقة الطرد المركزي بالكثافة المتدرجة.
- عزلة الخلايا البيضاء مع تجنب تلوث خلايا الدم الحمراء.
- غسل الخلايا في PBS جديد لتحليل إضافي.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للخلايا التائية CD4 + من الدم المحيطي.
- القدرة على اكتشاف مجموعات الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد.
- إثبات حساسية الاختبار للاستجابات المناعية الضعيفة.
- إمكانية تقليد الخلايا التائية الخاصة بالمستضد للبحث.
الاستنتاجات
- يعزز هذا البروتوكول القدرة على دراسة استجابات الخلايا التائية CD4 +.
- يوفر أداة قيّمة لأبحاث الأمراض المناعية الذاتية.
- يمكن تكييف الطريقة لمختلف المحفزات المضادة للمستضد.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This CFSE-based proliferation assay enables biopharma R&D teams to detect, quantify, and isolate rare antigen-specific CD4+ T cell responses in human PBMCs without requiring prior epitope knowledge. The method supports target validation and mechanistic de-risking in autoimmune disease programs by providing functional readouts of T cell reactivity to self-antigens such as pro-insulin C-peptide. Its compatibility with downstream sorting and cloning facilitates lead identification and preclinical biomarker alignment for immunotherapeutic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring antigen-driven proliferation of rare CD4+ T cell populations in human samples.
- Operational Value: Provides a sensitive, dye-dilution readout that distinguishes antigen-specific responders from bystander cells via flow cytometry.
- Predictive Value: Supports functional target validation and biological de-risking of autoimmune targets like pro-insulin in type 1 diabetes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative proliferation data suitable for screening antigenic libraries or peptide pools.
- Reproducibility: CFSE dilution allows consistent tracking of cell division cycles across replicates and donors.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats and flow cytometric analysis for medium-throughput immune profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables isolation of viable, antigen-specific CD4+ T cells for downstream applications such as cloning and phenotypic characterization.
- Biomarker Alignment: Supports identification of T cell responses relevant to disease states, exemplified by detection in type 1 diabetes donors.
- Preclinical De-risking: Provides functional immune response data to inform go/no-go decisions in early-stage immunomodulator programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early immune profiling to lead identification, particularly for immunomodulators targeting autoimmune pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human PBMCs.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible outputs for evaluating antigenic stimuli or immunomodulatory compounds.
- Analytics: Enables calculation of division index and proliferation metrics that allow comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work through isolation of viable responding cells for further functional analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for immune monitoring across multiple antigen targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through direct measurement of antigen-specific T cell proliferation.
- Operational Value: Standardized, reproducible workflow with minimal hands-on time and compatibility with existing flow cytometry infrastructure.
- Strategic Value: Informs early go/no-go decisions by de-risking mechanistic assumptions about autoimmune target relevance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on functional human T cell data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human PBMC isolation, flow cytometry, and CFSE-based proliferation assays.
- Dependent on access to flow cytometers capable of multicolor compensation and viable cell sorting.
- Necessitates standardization of antigen preparation, incubation times, and gating strategies across users and sites.
- Adaptation to alternative model systems may require validation of dye retention and proliferation kinetics.
- Practical limitations include assay duration (7–14 days) and sensitivity to cell viability and handling during isolation.
