تصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال البشرية

يتمثل الهدف العام لتقنية التصوير والتحليل هذه في عزل معلومات محددة من إشارة معقدة. وبشكل أكثر تحديداً، يصف هذا البروتوكول كيفية تصوير وقياس الميتوكوندريا الخاصة بالأعصاب وتمييزها عن الميتوكوندريا الأخرى داخل البشرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال طب الأعصاب، مثل كيفية مقارنة الميتوكوندريا الموجودة داخل الألياف العصبية داخل البشرة لدى الأفراد الأصحاء بالميتوكوندريا الخاصة بالأعصاب لدى المرضى الذين يعانون من مضاعفات عصبية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتنا على أخذ إشارة معقدة واستخراج معلومات محددة منها. يساعدنا هذا البروتوكول على عزل إشارة معينة، مثل الإشارة الموجودة في هذه القشات، عن الإشارات المحيطة بها. استعد لإجراء صبغ الكيمياء النسيجية المناعية الفلورية لخزعات الجلد من خلال تسمية طبق ذي 96 بئراً أولاً وفقاً لهذا المخطط.

بعد ذلك، اسحب بواسطة الماصة 150 µL من محلول تعزيز الإشارة المركز لتقليل الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة الثانوية في كل بئر من آبار الصف العلوي. قم بتجهيز آبار الشطف عن طريق إضافة 150 µL من محلول phosphate buffered saline بتركيز 1x في كل بئر في الصفين الثاني والثالث من طبق الـ 96-well plate. ثم أضف 150 µL من محلول حجب 5%BSA في آبار الصف الرابع.

قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية PGP9.5 و PDH في 1,500 µL من محلول شطف 1%BSA، وأضف 150 µL إلى كل بئر في الصف الخامس. استخدم عروة تلقيح لنقل المقاطع إلى محلول تعزيز الإشارة في الصف الأول. وبمجرد وضع المقاطع في محلول الجسم المضاد الأولي في الصف الخامس، غلف الطبق بإحكام بغشاء مختبري لمنع التبخر، ثم قم برج العينات على هزاز مسطح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

يُحضن العينة مع التقليب المستمر طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. ابدأ اليوم الثاني من الإجراء بنقل 150 µL من محلول الشطف 1%BSA إلى الآبار الموجودة في الصفوف السادس والسابع والثامن من صفيحة 96-well plate. أضف الأجسام المضادة الثانوية المتقارنة بالفلوروفور إلى 1,500 µL من 1%BSA.

بعد ذلك، قم بنقل 150 microliters من محلول الجسم المضاد الثانوي باستخدام الماصة إلى كل بئر من آبار الصف التاسع. اشطف المقاطع بتمريرها عبر الآبار السادسة والسابعة والثامنة. وبمجرد وصول المقاطع إلى محلول الجسم المضاد الثانوي في الصف التاسع، غلف الطبق بـ parafilm وغطه بورق الألمنيوم لحماية إشارات الفلورة.

يتم التحضين مع الهز كما سبق. في اليوم الثالث، يتم نقل 150 µL من محلول 1x PBS المفلتر والمعقم إلى الصفوف 10 و11 و12. يتم نقل العينات إلى الصف 10 ثم تُغطى اللوحة بورق الألومنيوم.

اشطف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الهز المستمر. بعد ذلك، قم بتجهيز شريحة مجهرية لتثبيت المقاطع عن طريق سحب 50 µL من محلول 1x PBS المرشح ووضعها على الشريحة. بمجرد اكتمال عمليات الشطف، انقل مقطعاً من الصف 12 إلى الشريحة، ثم أضف قطرة إلى قطرتين من كاشف التثبيت الذي يحتوي على DAPI مباشرة فوق المقطع.

ضع برفق غطاء شريحة مجهرية زجاجياً بمقاس 50 مليمتر في 24 مليمتر وسمك 1.5 فوق المقطع. ضع الشرائح في الظلام طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لتصلب وسط التثبيت قبل تخزين الشرائح أو تصويرها. اختر العدسة الشيئية الغمرية الزيتية 40X في مجهر بؤري مسحي ليزري مقلوب.

اختر الليزرات والكواشف المناسبة لتصوير النوى، والألياف العصبية، والميتوكوندريا. أدخل معاملات المسح التالية في برنامج المجهر: دقة شدة 12-bit، ومعدل مسح 500 Hertz مع متوسط إطارين، وتكبير 2.2. اضبط برنامج المجهر لتحقيق دقة جانبية مثالية عن طريق اختيار دقة مسح 1024 by 1024.

قم بتحسين الدقة المحورية والتقطيع البصري عن طريق اختيار فتحة بؤرية (confocal aperture) بمقدار وحدة هوائية واحدة مع حجم خطوة Z قدره 210 nanometers. قم بمسح كل إشارة على حدة واضبط جهد الكاشف والإزاحة (offset) لإزالة أي بكسلات مشبعة بشكل زائد أو ناقص. قم بتنشيط المسح المباشر لإشارة العصب واضبط تحكم تركيز Z لتحديد وضبط المستويين البؤريين العلوي والسفلي في برنامج المجهر بحيث تشمل إشارة العصب ضمن المقطع النسيجي.

قم بمسح سلسلة Z النهائية باستخدام المسح المتسلسل للقضاء على التداخل في إشارات الفلورة. اعزل البشرة عن الطبقة القرنية والأدمة عن طريق رسم منطقة حول البشرة باستخدام أداة التحديد على نسخة مكررة من الصورة الأصلية، ثم قم بقص الصورة وفقاً للتحديد.

قم بحساب دالات انتشار النقطة (point spread functions) لإشارات الفلورة الخضراء والحمراء في المجهر البؤري باستخدام ميزة حساب دالة الانتشار. ثم قم بضبط معلمات معامل الانكسار للوسط الزيتي عند 1.515، والفتحة العددية للعدسة الشيئية الزيتية 40X عند 1.25. اضبط ثقب الكاشف (detector pinhole) عند وحدة هوائية واحدة واختر الطول الموجي لإثارة الليزر.

استخدم الاستعادة التكرارية (iterative restoration) مع ضبط مستوى الثقة على 100%، وحد تكرار يبلغ 10 دورات، واستخدم دوال انتشار النقطة (PSFs) الخضراء والحمراء لإلغاء تلافيف إشارات الفلورة الخضراء والحمراء. استخدم أداة إنشاء السطح (create surface tool) لعمل سطح حول إشارات العصب التي تم إلغاء تلافيفها، مع تحديد خيار عدم تنعيم الميزة (uncheck smooth feature)، واستخدام الشدة المطلقة (absolute intensity) لتحديد العتبة، وعتبة سفلى تبلغ 3,000 وعتبة عليا تبلغ 65,535. احتفظ بالأسطح التي تزيد عن 10 voxels.

قم بإزالة الأسطح غير العصبية باستخدام علامة التبويب "edit" في "nerve surface" لتحديد أسطح غير عصبية مفردة، أو استمر في الضغط على مفتاح Control لتحديد عدة أسطح غير عصبية. احذف الأسطح غير العصبية المحددة بالضغط على زر Delete. استخدم علامة التبويب "edit" في "nerve surface" واضغط على زر "mask all" في "mask properties".

في النافذة الجديدة، اختر القناة الخامسة mitochondria deconvolved ضمن قائمة اختيار القناة (channel selection)، ثم حدد خيار duplicate channel قبل تطبيق القناع. اضغط على زر الخيار الخاص بـ constant inside/outside، وقم بتعيين set voxels outside surface إلى 0.0، ثم اضغط على زر OK. وأخيراً، أنشئ أسطحاً خاصة بالميتوكوندريا باستخدام أداة create surface لعمل سطح يحيط بإشارات الميتوكوندريا المفككة والمقنعة، وذلك عن طريق إلغاء تحديد smooth feature واستخدام background subtraction لتحديد العتبة (thresholding).

اضبط قطر أكبر كرة على 1.50 micrometers، والعتبة السفلية على 2,000 والعتبة العلوية على الحد الأقصى 65,535. تأكد من إبقاء الأسطح أعلى من 1.0 voxels. توضح هذه الصورة الممثلة بالمجهر البؤري ثلاثي الأبعاد إشارة الفلورة الخضراء الخاصة بالأعصاب.

يتم إنشاء سطح ثلاثي الأبعاد يظهر باللون السماوي لإشارة العصب. بعد ذلك، يتم عزل إشارة الميتوكوندريا الخاصة بالعصب عن بقية إشارات ميتوكوندريا البشرة باستخدام سطح العصب كأداة قناع. وتُستخدم إشارة الفلورة الحمراء للميتوكوندريا الخاصة بالعصب الناتجة لإنشاء أسطح تظهر باللون الأرجواني حول الميتوكوندريا داخل سطح العصب الذي يظهر باللون السماوي.

يسمح هذا برؤية الميتوكوندريا في الألياف العصبية بالتفصيل. وهنا، تُعرض بيانات سطح الميتوكوندريا في شكل مدرج تكراري للحجم لتصوير النسبة المئوية للميتوكوندريا الموجودة في كل من الانحناءات المختلفة وفقاً لحجمها. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم العناية بالنسيج خلال عملية الصبغ لضمان غمر النسيج بالكامل في المحاليل لتوفير صبغ متساوٍ ومتسق عبر المقاطع.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور وقياس كمية الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية البشرية داخل البشرة. لقد صُمم بروتوكولنا التفصيلي لتعليم الباحثين الآخرين كيفية صبغ وتصوير ومعالجة وتحليل خزعات الجلد البشري بهدف فهم الآليات الكامنة وراء إمراضية الأمراض العصبية القائمة على الميتوكوندريا مثل الاعتلال العصبي.