تصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال البشرية
September 29th, 2017
هذا البروتوكول يستخدم تقنيات التصوير والتحليل (3D) ثلاثي الأبعاد لتصور وتحديد حجم الميتوكوندريا العصب على حدة. التقنيات قابلة للتطبيق على حالات أخرى حيث يتم استخدام إشارة الفلورسنت واحدة لعزل مجموعة فرعية بيانات من آخر إشارة الفلورسنت.
الهدف العام من تقنية التصوير والتحليل هذه هو عزل معلومات محددة عن إشارة معقدة. على وجه التحديد ، يصف هذا البروتوكول كيفية تصور وقياس الميتوكوندريا الخاصة بالأعصاب مع الميتوكوندريا الأخرى داخل البشرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب مثل كيف تقارن الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية داخل البشرة للأفراد الأصحاء بالميتوكوندريا الخاصة بالأعصاب للمرضى الذين يعانون من مضاعفات عصبية.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نأخذ إشارة معقدة ونستخرج معلومات محددة منها. يساعدنا هذا البروتوكول على عزل إشارة معينة مثل الإشارة الموجودة في هذه القشات عن الإشارات المحيطة بها. استعد لتلوين الكيمياء المناعية الفلورية لخزعات الجلد عن طريق وضع العلامات أولا على لوحة مكونة من 96 بئرا وفقا لهذا المخطط.
ثم قم بعمل ماصة 150 ميكرولترا من محلول محسن إشارة المخزون لتقليل الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة الثانوية في كل بئر من الصف العلوي. قم بإعداد شطف الآبار عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن 1x من الفوسفات في كل بئر في الصفين الثاني والثالث من اللوحة المكونة من 96 بئرا. ثم أضف 150 ميكرولتر من محلول حجب BSA بنسبة 5٪ في آبار الصف الرابع.
قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية PGP9.5 و PDH في 1 ، 500 ميكرولتر من محلول شطف BSA 1٪ وأضف 150 ميكرولتر إلى كل بئر في الصف الخامس. استخدم حلقة تلقيح لنقل الأقسام إلى محلول محسن الإشارة في الصف الأول. بمجرد أن تصبح الأقسام في محلول الجسم المضاد الأساسي في الصف الخامس ، لف اللوحة بإحكام بغشاء مختبري لمنع التبخر ثم حرك العينات على هزاز مسطح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
احتضن مع التأرجح بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ابدأ اليوم الثاني من الإجراء عن طريق سحب 150 ميكرولتر من محلول شطف BSA بنسبة 1٪ على الآبار في الصفوف السادسة والسابعة والثامنة من اللوحة المكونة من 96 بئرا. أضف الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور إلى 1،500 ميكرولتر من 1٪ BSA.
ثم ماصة 150 ميكرولترا من محلول الجسم المضاد الثانوي في كل بئر من الصف التاسع. اشطف الأقسام بالمرور عبر الآبار السادسة والسابعة والثامنية. بمجرد أن تصبح الأقسام في محلول الجسم المضاد الثانوي في الصف التاسع ، لف اللوحة في بارافيلم وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم لحماية إشارات الفلورة.
احتضان مع التأرجح كما كان من قبل. في اليوم الثالث ، تمت ترشيح الماصة 150 ميكرولترا من المعقمة 1x PBS في الصفوف 10 و 11 و 12. انقل العينات إلى الصف 10 ثم قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم.
اشطفها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة بالهزاز. بعد ذلك ، قم بإعداد شريحة مجهر لتركيب الأقسام عن طريق سحب 50 ميكرولترا من 1x PBS المصفى على الشريحة. بمجرد اكتمال عمليات الشطف ، انقل قسما من الصف 12 إلى الشريحة ثم أضف قطرة إلى قطرتين من كاشف التثبيت الذي يحتوي على DAPI مباشرة أعلى القسم.
ضع برفق غطاء زجاجي مقاس 50 ملم × 24 ملم 1.5 مجهر فوق القسم. ضع الشرائح في الظلام طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لمعالجة وسط التركيب قبل تخزين الشرائح أو تصويرها. حدد هدف الغمر بالزيت 40X على مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر المقلوب.
حدد الليزر وأجهزة الكشف المناسبة لتصوير النوى والألياف العصبية والميتوكوندريا. أدخل معلمات المسح التالية في برنامج المجهر ، ودقة شدة 12 بت ، ومعدل مسح 500 هرتز بمتوسط إطارين ، وتكبير 2.2. اضبط برنامج المجهر للحصول على دقة جانبية محسنة عن طريق تحديد دقة مسح ضوئي تبلغ 1024 × 1024.
قم بتحسين الدقة المحورية والتقسيم البصري عن طريق تحديد فتحة متحدة البؤر لوحدة هواء واحدة بحجم خطوة Z يبلغ 210 نانومتر. امسح كل إشارة على حدة واضبط جهد الكاشف والإزاحة لإزالة أي وحدات بكسل مشبعة أكثر أو أقل. قم بتنشيط المسح المباشر للإشارة العصبية واضبط التحكم في التركيز بتركيز Z للعثور على المستويين البؤريين العلوي والسفلي وضبطهما في برنامج المجهر الذي يشمل الإشارة العصبية داخل قسم الأنسجة.
امسح سلسلة Z النهائية ضوئيا باستخدام مسح متسلسل للتخلص من الحديث المتبادل لإشارة التألق. اعزل البشرة عن الطبقة القرنية والأدمة عن طريق رسم منطقة حول البشرة باستخدام أداة تحديد على صورة مكررة للصورة الأصلية. ثم قم بقص الصورة إلى التحديد.
احسب وظائف انتشار النقطة للإشارات البؤرية الفلورية الخضراء والحمراء باستخدام ميزة حساب الدالة المنتشرة. ثم اضبط معلمات معامل الانكسار المتوسط للزيت عند 1.515 والفتحة العددية لهدف الزيت 40X عند 1.25. اضبط ثقب الكاشف في وحدة هواء واحدة واختر الطول الموجي للإثارة بالليزر.
استخدم مجموعة الاستعادة التكرارية على ثقة 100٪ ، وحد التكرار البالغ 10 دورات ، و PSFs الخضراء والحمراء لإزالة الاهتزاج من إشارات التألق الخضراء والحمراء. استخدم أداة إنشاء السطح لإنشاء سطح حول الإشارات العصبية غير الملتوية لتحديد ميزة إلغاء التحديد السلسة ، والكثافة المطلقة للعتبة ، وعتبة أقل من 3 ، 000 وعتبة عليا تبلغ 65 ، 535. حافظ على الأسطح فوق 10 فوكسيل.
قم بإزالة الأسطح غير العصبية باستخدام علامة تبويب التحرير في سطح العصب لتحديد أسطح مفردة غير عصبية أو اضغط باستمرار على مفتاح التحكم لتحديد أسطح غير عصبية متعددة. احذف الأسطح غير العصبية المحددة بالضغط على الزر حذف. استخدم علامة تبويب التحرير في سطح العصب واضغط على زر القناع الكل في خصائص القناع.
في النافذة الجديدة ، حدد القناة الخامسة من الميتوكوندريا التي تم فكها تحت تحديد القناة ثم تحقق من القناة المكررة قبل تطبيق القناع. اضغط على زر الاختيار للثبات من الداخل / الخارج وتحقق من ضبط فوكسل السطح الخارجي إلى 0.0 واضغط على الزر موافق. أخيرا ، قم بإنشاء أسطح خاصة بالميتوكوندريا باستخدام أداة إنشاء سطح لإنشاء سطح حول إشارات الميتوكوندريا المقنعة عن طريق تحديد ميزة إلغاء تحديد السلس واستخدام طرح الخلفية للعتبة.
اضبط قطر أكبر كرة على 1.50 ميكرومتر ، والعتبة الدنيا إلى 2 ، 000 ، والعتبة العليا إلى 65 ، 535 كحد أقصى. تأكد من إبقاء الأسطح أعلى من 1.0 فوكسل. توضح هذه الصورة المجهرية متحد البؤر ثلاثية الأبعاد إشارة التألق الأخضر الخاصة بالعصب.
يتم إنشاء سطح ثلاثي الأبعاد موضح باللون السماوي للإشارة العصبية. ثم يتم عزل إشارة الميتوكوندريا الخاصة بالعصب عن بقية إشارات الميتوكوندريا للبشرة باستخدام سطح العصب كأداة إخفاء. يتم استخدام إشارة التألق الأحمر للميتوكوندريا الناتجة الخاصة بالعصب لإنشاء أسطح تظهر على شكل أرجواني حول الميتوكوندريا داخل سطح العصب والتي تظهر في السماو.
هذا يسمح برؤية الميتوكوندريا في الألياف العصبية بالتفصيل. هنا ، يتم تقديم بيانات سطح الميتوكوندريا كرسم بياني لتردد الحجم لتصور النسبة المئوية للميتوكوندريا الموجودة في كل من الانحناءات المختلفة وفقا لحجمها. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم العناية بالأنسجة أثناء عملية التلوين للتأكد من أن الأنسجة مغمورة بالكامل في المحاليل لتوفير تلطيخ متساو ومتسق في جميع أنحاء الأقسام.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور وقياس الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية داخل البشرة البشرية. تم تصميم بروتوكولنا التفصيلي لتعليم الباحثين الآخرين كيفية تلطيخ خزعات جلد الإنسان وتصويرها ومعالجتها وتحليلها بهدف فهم الآليات الكامنة وراء التسبب في الأمراض العصبية القائمة على الميتوكوندريا مثل الاعتلال العصبي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول تقنية لتصوير وتقدير الميتوكوندريا الخاصة بالأعصاب باستخدام التصوير والتحليل ثلاثي الأبعاد. يسمح للبحوث بعزل إشارات الميتوكوندريا المحددة من الخلفيات المعقدة، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم الحالات العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- التصوير الفلوري
الخلفية
- تلعب الميتوكوندريا دورًا حاسمًا في استقلاب الطاقة الخلوية.
- فهم وظيفة الميتوكوندريا في ألياف الأعصاب يمكن أن يوفر رؤى حول الأمراض العصبية.
- النسيجية المناعية الفلورية هي تقنية رئيسية لتصوير الهياكل الخلوية.
- يمكن لهذه الطريقة التمييز بين السلوك الميتوكوندريا الصحي والمرضي.
هدف الدراسة
- لتصوير الميتوكوندريا الخاصة بالأعصاب داخل البشرة.
- لمقارنة خصائص الميتوكوندريا في الأفراد الأصحاء مقابل المرضى الذين يعانون من مضاعفات عصبية.
- لتعزيز فهم أدوار الميتوكوندريا في وظيفة الأعصاب.
الطرق المستخدمة
- تلطيخ النسيجية المناعية الفلوري لخزعات الجلد.
- تقنيات التصوير ثلاثي الأبعاد لتحليل البيانات.
- عزل إشارات الميتوكوندريا المحددة من الخلفيات الفلورية المعقدة.
- تحليل كمي لتوزيع الميتوكوندريا وخصائصها.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح للميتوكوندريا الخاصة بالأعصاب في عينات البشرة.
- تحديد الاختلافات في خصائص الميتوكوندريا بين الأفراد الأصحاء والمتأثرين.
- برهنة فعالية التصوير ثلاثي الأبعاد في عزل إشارات محددة.
- رؤى حول دور الميتوكوندريا في الصحة العصبية والمرض.
الخلاصات
- يوفر هذا البروتوكول أداة قيّمة لدراسة وظيفة الميتوكوندريا في ألياف الأعصاب.
- القدرة على عزل إشارات محددة تعزز فهم النظم البيولوجية المعقدة.
- يمكن للبحوث المستقبلية البناء على هذه النتائج لاستكشاف الأهداف العلاجية في علم الأعصاب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise isolation and quantification of mitochondria within human intraepidermal nerve fibers, addressing a critical need in neurology research to de-risk target validation by providing disease-relevant, quantitative mitochondrial phenotypes. The method supports mechanistic de-risking in preclinical models by allowing direct comparison of mitochondrial characteristics between healthy and neurologically affected tissues, thereby improving predictive confidence in target selection for neurodegenerative disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating nerve-specific mitochondrial signals from complex epidermal backgrounds, clarifying pathway involvement in mitochondrial dysfunction.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible workflow for functional target validation using disease-altered mitochondrial morphology as a biomarker.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying mitochondrial size frequency distributions, enabling objective assessment of target engagement and biological de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, imaging-based readouts (e.g., mitochondrial volume, surface data) suitable for high-content screening platforms assessing compound effects on nerve-specific mitochondria.
- Reproducibility: Defines consistent parameters for staining, acquisition, and analysis, ensuring assay standardization across laboratories and timepoints for reliable compound evaluation.
- Scalability: The 3D imaging and analysis pipeline can be adapted to multi-well formats, supporting scalable screening of therapeutic candidates in disease-relevant human tissue models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly examines mitochondria in human sensory nerve fibers, providing a translationally accurate model for neuropathy and other mitochondrial-based neurologic diseases.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling longitudinal assessment of mitochondrial alterations in the same tissue system used for target identification.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by linking mitochondrial phenotypes to neurological complications, reducing late-stage failure due to unanticipated biological mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, specifically enabling mechanistic de-risking of mitochondrial targets in neurodegenerative disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating nerve-specific mitochondria to clarify their role in axonal integrity and energy metabolism in sensory neurons.
- Screening: Delivers quantitative, standardized outputs (e.g., mitochondrial size frequency histograms) that allow comparison of compound-treated versus control conditions in human tissue.
- Analytics: Generates 3D surface data and threshold-based measurements that enable statistical analysis of mitochondrial distribution and morphology across experimental groups.
- Translational Research: Uses human skin biopsies to maintain disease relevance, ensuring findings are directly applicable to human neuropathy pathophysiology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis capability for studying mitochondrial dynamics in various nerve fiber types across multiple neurodegenerative indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial involvement in nerve fiber degeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined staining, imaging, and analysis parameters, minimizing inter-user variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of mitochondrial targets, reducing investment in targets with poor biological validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative mitochondrial phenotypes that inform advancement decisions in neurology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence immunohistochemistry and confocal microscopy for proper antibody labeling and signal detection.
- Dependent on laser scanning confocal microscopy with specific objectives (40X oil immersion) and spectral separation capabilities for green and red fluorophores.
- Necessitates 3D image analysis software capable of deconvolution, surface creation, masking, and threshold-based segmentation.
- Requires consistency in staining, acquisition, and analysis parameters across batches to ensure comparability of mitochondrial measurements.
- Limited to tissue systems where nerve-specific markers (e.g., PGP9.5) and mitochondrial markers (e.g., PDH) can be effectively labeled and distinguished from background signals.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 1
9:39
Conclusion
8:41
Results: Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers
2:27
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 2
3:21
Fluorescence Immunohistochemistry: Day 3
4:22
Confocal Imaging
6:00
Image Processing
7:03
Isolation of Nerve-specific Mitochondrial Signal
