Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Yongchao Mou; Sukhada Mukte; Eric Chai; Joshua Dein; Xue-Jun Li

doi:10.3791/60548

تحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في الخلايا العصبية الجذعية المستحثة البشرية متعددة القدرات ال...

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

تحليل نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في الخلايا العصبية الجذعية المستحثة البشرية متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية في الشلل النصفي التشنجي الوراثي

Full Text

8,214 Views

07:32 min

February 9, 2020

DOI: 10.3791/60548-v

Yongchao Mou^1,2, Sukhada Mukte¹, Eric Chai¹, Joshua Dein³, Xue-Jun Li^1,2

¹Department of Biomedical Sciences,University of Illinois College of Medicine Rockford, ²Department of Bioengineering,University of Illinois at Chicago, ³MD Program,University of Illinois College of Medicine Rockford

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study investigates mitochondrial transport and morphology using induced pluripotent stem cell-derived forebrain neurons in the context of hereditary spastic paraplegia. The protocol allows for detailed assessment of mitochondrial dynamics along axons, contributing to the understanding of neurodegenerative diseases.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Cell Biology
Neurodegenerative Diseases

Background

Mitochondrial dysfunction is a key factor in various neurodegenerative diseases.
Impaired mitochondrial transport and morphology have been linked to axonal degeneration.
The use of induced pluripotent stem cells provides a relevant model for studying human neural processes.

Purpose of Study

To develop a protocol for examining mitochondrial behavior in axons.
To elucidate the relationship between mitochondrial dynamics and neurodegenerative disease mechanisms.
To identify potential therapeutic targets for conditions like hereditary spastic paraplegia.

Methods Used

Cell culture of induced pluripotent stem cell-derived forebrain neurons.
Live cell imaging combined with mitochondrial labeling to assess mitochondrial tracking.
Important steps include dissociation of neurospheres and proper staining with fluorescent dyes.
Image analysis performed using ImageJ, including the generation of kymographs.

Main Results

Characterization of mitochondrial transport revealed significant differences in mitochondrial dynamics.
Quantitation of mitochondrial length and movement showed reduced motility in neurons derived from hereditary spastic paraplegia models.
Findings underscore the importance of mitochondrial function in neural health and disease.

Conclusions

This study provides a vital experimental approach to analyze mitochondrial dynamics in the context of neurodegeneration.
The insights gained can inform future therapeutic strategies targeting mitochondrial dysfunction.
The methodology may enhance our understanding of neuronal mechanisms and disease progression.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using induced pluripotent stem cells for this study?

Induced pluripotent stem cells offer a human-relevant model to explore mitochondrial function and dynamics, allowing for insights directly applicable to human disease.

How is mitochondrial transport assessed in this protocol?

Mitochondrial transport is assessed via live cell imaging, using fluorescent dyes to visualize and track mitochondrial dynamics along the axons.

What outcomes can be measured with this protocol?

Key outcomes include mitochondrial length, area, transport velocity, and motility characteristics, which are crucial for understanding neuronal health.

Can this method be adapted for other types of neurons?

Yes, this methodology can be adapted for other neuronal types by using appropriate differentiation protocols and imaging techniques specific to those neurons.

What are some limitations of this study?

Limitations may include the inability to fully replicate in vivo conditions and potential variability in stem cell differentiation outcomes.

How does this study contribute to the understanding of neurodegenerative diseases?

By using human-derived neurons to study mitochondrial dysfunction, the findings enhance our understanding of the cellular mechanisms underlying neurodegenerative diseases.

ويشارك ضعف نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في مختلف الأمراض العصبية التنكسية. يستخدم البروتوكول المقدم الخلايا العصبية الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة لتقييم نقل الميتوكوندريا والمورفولوجيا في الشلل النصفي التشنجي الوراثي. يسمح هذا البروتوكول بتوصيف الاتجار بالميتوكوندريا على طول المحاور وتحليل مورفولوجيا ها ، مما سيسهل دراسة الأمراض العصبية.

الخلل في الميتوكوندريا يكمن وراء العديد من الأمراض العصبية. بروتوكولنا يوفر أداة هامة لدراسة ديناميات الميتوكوندريا في محاور عصبية، وتسهيل دراسة الأمراض العصبية التي تنطوي على انحطاط عصبي. من خلال الجمع بين وضع العلامات الميتوكوندريا، والتصوير الحي للخلايا وتكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات، يمكن استخدام بروتوكولنا لتوصيف الاتجار بالميتوكوندريا على طول المحاور البشرية وتحليل الصفات المورفورية الخاصة بها.

ويمكن ملاحظة ضعف في نقل الميتوكوندريا ومورفولوجيا في ثقافات الخلايا الجذعية والنماذج الحيوانية للأمراض العصبية التي توفر أهدافا علاجية محتملة لعلاج هذه الأمراض. بعد يوم خمسة وثلاثين من الثقافة، وفصل الخلايا العصبية التي تم تمييزها من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان إلى مجموعات صغيرة مع 1 ملغ/مل من محلول انفصال الخلايا لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة جمع مجموعات الخلية عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من NDM.

لوحة حوالي خمس مجموعات من الخلايا في مائة ميكرولتردات من المتوسط في بوليورينيثين واللاكتوز dehydrogenase رفع الفيروس خالية من فيروس انخفاض عامل النمو غشاء الطابق السفلي مصفوفة المغلفة 35 ملليمتر الأطباق القاع الزجاجي. ثم إضافة ملليلتر واحد من NDM تكملها B27، دوري أدينوسين أحادي الفوسفات، عامل النمو مثل الأنسولين، عامل التغذية العصبية المشتقة من الدماغ البشري وعامل التغذية العصبية المستمدة من الخلايا الدبقية إلى كل ثقافة. لتصور الميتوكوندريا على طول محاور عصبية من الخلايا العصبية forebrain وصمة عار الخلايا العصبية مع 50 نانومولار صبغة فلورية حمراء في NDM لمدة ثلاث دقائق في 37 درجة مئوية تليها اثنين من يغسل في NDM الدافئة.

بعد ذلك، ضع الثقافة على خشبة مسرح المجهر المفلور واختر الهدف 40X. في إطار حقل المرحلة تحديد محاور أساس خصائصها المورفولوجية. لتمييز اتجاه حركة الميتوكوندريا على طول المحاور تحديد بوضوح خلايا الخلايا العصبية.

بعد التمييز بين الجسم الخلية ومحور عصبي ضبط وقت التعرض والتركيز من الميتوكوندريا في المحاور والتقاط النقل الميتوكوندريا داخل المحاور كل خمس ثوان لما مجموعه خمس دقائق. لتحليل النقل الميتوكوندريا في ImageJ فتح فيجي وحدد المساعد تنسيقات الحيوي. استخدم مستورد التنسيقات الحيوية لاستيراد الصور الفاصلة زمنيًا لسلسلة tiff وحدد ImageJ القياسي وفتح كل السلسلة.

تحقق من تقسيم القنوات تلقائياً وانقر فوق موافق مع الحرص على ملاحظة رقم الإطار وحجم الصور بالبكسل. بعد ضبط السطوع والتباين لجميع الإطارات 60 استخدام خط مجزأة لرسم خط من جسم الخلية إلى محور عصبي المحطة الطرفية. لإنشاء Kymograph حدد البرنامج المساعد كيموغراف متعددة وحدد عرض الخط.

لقياس المسافة، والقيم الزمنية والسرعة للميتوكوندريا المتحركة المفتوحة tsp050607. txt في البرنامج المساعد وحدات الماكرو. ورسم خط مجزأة على أثر حركة الميتوكوندريا على kymograph من أعلى إلى المنطقة الأدنى.

بعد رسم خط فتح سرعات القراءة من ملعقة صغيرة في المساعد وحدات الماكرو لقراءة السرعات المجزأة المقابلة للخط. المقبل فتح الصورة الأصلية واستخدام أداة خط لرسم خط على طول شريط المقياس. حدد التحليل لقياس طول الخط وتحويل dx الآن ووحدات المسافة من وحدات البكسل إلى ميكرومتر.

ثم قم بتغيير الوقت من البكسل إلى الثواني. لتحليل طول الميتوكوندريا والمساحة داخل المحاور في ImageJ تثبيت تثبيت سقسقة نقطة سفلية المساعد JAR وفتح صورة محور عصبي من الفائدة. تحويل صورة 32 بت إلى ثمانية بت واستخدام أداة خط مجزأة لتتبع محور عصبي.

حدد البرنامج المساعد سفلي مستقيم JAR وتعيين عرض خط خيوط واسعة إلى 50 بكسل. تتبع محور عصبي مرة أخرى لتوليد محور عصبي مستقيم وضبط عتبة الصورة. حدد تحليل مجموعة القياسات التي تناسب حدود القطع الناقص وواصفات الشكل لتعيين القياس واستخدام وظيفة الخط لقياس شريط المقياس في الصورة الأصلية كما هو موضح.

تحت تحليل وتعيين مقياس أدخل المسافة في المسافة بكسل المعروفة ووحدة الطول لتعيين مقياس. ثم حدد العمومية لتعيين إعداد مقياس إلى كافة الصور. وأخيراً حدد تحليل وتحليل الجسيمات لتحديد المنطقة وتحديد نتائج العرض لعرض القياس الناتج.

بعد التمايز في الخلايا العصبية الغلوتاماتيرية التي لا الدماغ يمكن أن تتميز الخلايا من قبل بهم T-B-R واحد وبيتا ثلاثة تعبير علامة tubulin. يلطّخ مع أحمر صبغة فلورسنت ووقت الفاصل تصوير يسمح تقييم النقل المحوري للميتوكوندريا. يمكن أن يظل الميتوكوندريون الواحد ثابتًا أو يتحرك في اتجاه اظرون أو رجعي داخل محور عصبي.

ويمكن تحديد سرعة حركة الميتوكوندريا على طول محور عصبي كما هو موضح. على سبيل المثال باستخدام برامج التحليل المتاحة تجارياً، يتم تخفيض النسبة المئوية للميتوكوندريا المتحركة بشكل كبير في الخلايا العصبية S-P-G-3-A مقارنة بالخلايا العصبية من النوع البري. لتحليل طول منطقة الميتوكوندريا ومحورات محور الارتفاع يمكن تقويمها في برنامج تحليل الصور وتحديدها عن طريق ضبط العتبة.

ويمكن بعد ذلك الحصول على عرض طول محيط منطقة الميتوكوندريا ونسبة العرض إلى الارتفاع من محور الدوران المُستقيم. على سبيل المثال يتم تقليل طول الميتوكوندريا ونسبة العرض إلى الارتفاع بشكل كبير في المحاور العصبية S-P-G 15 مقارنة بـتحكم في المحاور من النوع البري. من المهم تدفئة الوسط وحاضنة المجهر لغسل الخلايا بلطف والسماح للخلايا بالستقر لمدة عشرين دقيقة قبل التصوير.

بعد التصوير الخلية الحية يمكن إصلاح الثقافات واخضاعها للمناعة لفحص التعبير عن البروتينات الأخرى ذات الاهتمام. ومن الصعب دراسة ديناميات الميتوكوندريا في الأعصاب البشرية الحية. هذه التقنية توفر أداة فريدة لدراسة ديناميات الميتوكوندريا وانحطاط الأعصاب في الأمراض العصبية.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos