تصور جسيم داخلي حيوية في محطات عصب المعيشة مع رباعية الابعاد التصوير الإسفار

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير الجسيمات الداخلية بدقة في مساحة ثلاثية الأبعاد بمرور الوقت أو في أربعة أبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح عضلات الثعبان أولا وترتيب الأنسجة في طبق التصوير. الخطوة الثانية هي تلطيخ الأنسجة بالأصباغ الحيوية لتحفيز تكوين الجسيمات الداخلية.

بعد ذلك ، يتم تصوير المستحضر في أربعة أبعاد لواحد أو أكثر من الوصلات العصبية العضلية. الخطوة الأخيرة هي تحليل البيانات الدقيق لتوصيف سلوك الجسيمات الداخلية الكبيرة. في النهاية ، يمكن إثبات وجود وحركة الجسيمات الداخلية بمرور الوقت داخل الفضاء قبل المشبكي من خلال التصوير الفلوري رباعي الأبعاد.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن عضلة بطن الثعبان هي ألياف واحدة فقط سميكة ، مما يسمح بإنشاء صور عالية الجودة باستخدام الفحص المجهري القياسي epi ، وسيتم استخدام مستحضرات الأنسجة من ثعبان الرباط في هذا البروتوكول. يجب الاحتفاظ بأنسجة الزواحف في درجات حرارة منخفضة ، بحيث تظل فسيولوجية لفترات أطول وبتلوث بكتيري أقل. لتلوين الصبغة الحيوية الليزوزومية ، يتم إذابة الصبغة من واحد إلى 5 ، 000 في محلول رنين الزواحف الباردة.

للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.2 ميكرومولار ، أضف الصبغة إلى الأنسجة واحتضن عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد 15 دقيقة ، اغسل المنديل عدة مرات باستخدام جرس بارد لجميع تلطيخ FM 1 43. قم بتركيب العينة مسبقا في طبق تصوير باستخدام دبابيس مغناطيسية قبل تلطيخها.

لغرض هذا الفيديو ، سيتم عرض تلطيخ FM 1 43 فقط باستخدام تحفيز كلوريد البوتاسيوم. تضاف الصبغة المخففة من واحد إلى 500 في جرعات عالية كلوريد البوتاسيوم للحصول على تركيز نهائي من سبعة ميكرومولار إلى الأنسجة ، ثم يتم تحضين الأنسجة عند أربع درجات مئوية لمدة أقصاها 30 إلى 60 ثانية. بعد ذلك ، يتم غسلها بسرعة ثلاث مرات باستخدام الرنين البارد لمدة دقيقة واحدة تقريبا لكل شطف.

يجب تصوير جميع الأنسجة في أسرع وقت ممكن بعد تلطيخها وغسلها بمحلول جرس بارد. إذا تم استخدام مجهر مقلوب ، فاستخدم غرفة تصوير يحتوي قاعها على زلة غطاء دائرية رفيعة. عادة ، يجب أن تحتوي غرفة التصوير على قاع رفيع من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 25 ملم.

انزلاق الغطاء الزجاجي السماكة رقم واحد في المركز لتكوين التحضير للتصوير. قم بتوجيهه باستخدام دبابيس مغناطيسية بحيث يتم توسيط العضلات على أفضل وجه ممكن داخل طبق التصوير ووضعها بشكل مسطح قدر الإمكان. غطي المستحضر بكمية صغيرة من محلول الرنين.

قم بتركيب الطبق ، ووضعه بالقرب من وسط المسرح قدر الإمكان. اختر هدفا مناسبا للحصول على أعلى دقة ثلاثية الأبعاد ممكنة. سيتم استخدام هدف مائي 63 × لجميع التجارب في هذا العرض التوضيحي.

لبدء هذا الإجراء، افتح نافذة التصوير في دفتر الشرائح 5.0. يتم تضمين العديد من القوائم هنا في علامات التبويب. أختر هدف الماء 63 × باستخدام علامة التبويب الثانية Z.تعيين الفاصل الزمني للمكدس Z.

في هذا المثال، يتم إستخدام خطوة Z بحجم 1.5 ميكرون للتصوير المباشر. حدد معدل إطارات اللقطات المتتابعة. المعدل الأمثل هو المعدل الكافي فقط لحل التغييرات بسلاسة بمرور الوقت ، مثل تفاعلات الحركة أو أحداث الاندماج.

على سبيل المثال ، 10 نقاط زمنية على فترات 32 لفاصل زمني إجمالي قدره خمس دقائق. بعد ذلك ، حدد العمق الكلي للمجال أثناء عرض الجهاز المباشر الذي يركز يدويا على الجزء العلوي من بؤرة الاهتمام ، ثم انتقل فوقه قليلا. حدد فك المجموعة.

ركز ببطء من خلال العينة حتى يخرج كل شيء عن نطاق التركيز. مرة أخرى ، سيشير عدد الطائرات وإجمالي قيم السفر المعروضة إلى عمق المجال المحدد في نافذة الالتقاط. حدد زر الاختيار المستخدم في المواضع العلوية والسفلية لنقل المعلمات المحددة للتو لالتقاط الصور ، ابدأ الحصول على الصور.

أكمل جميع الصور الحية لإعداد معين. احتفظ بجميع ملفات البيانات الأولية بينما لا يمثل التخزين الرقمي مشكلة عادة. وقت المعالجة مهم حتى مع أجهزة الكمبيوتر الشخصية السريعة أو محطة العمل.

لهذا السبب، يضمن اقتصاص الصور في منطقة ذات أهمية أن تكون منطقة الاهتمام بأكملها في النافذة التي تم اقتصاصها طوال الوقت. يمكن أن تتضمن الدورة التدريبية D مكدسات الصور باستخدام البرامج المناسبة ووظيفة انتشار النقاط الصحيحة ، والتأكد من تحسين الدقة وأنه لم يتم إنشاء أي أداة بواسطة خوارزمية فك الالتفاف. استخدم خوارزمية الاستيفاء لتوسيع المحور Z.

الدقة الظاهرة ، يقترح توسيع ستة × من فصل مستوى صورة فعلي 1.5 ميكرون إلى فصل واضح 0.25 ميكرون. قم بإجراء سطوع التباين وتصفية الضوضاء وتبييض الصور وتعديلات معالجة الصور النموذجية الأخرى. إذا رغبت في ذلك.

تملي معايير معالجة الصور أنه بالنسبة لمعظم الأعمال العلمية ، من المناسب تطبيق نفس التصحيحات على جميع الصور داخل المكدس وفي نقاط زمنية مختلفة. يجب تقييم نتيجة تعديل معين بين جميع الصور. جرب تقنيات التصفية وتحسين الصور المختلفة.

على سبيل المثال ، يعد lelos والتصفية مفيدا لزيادة تباين الهياكل الصغيرة فوق الخلفية. يتم تحسين سطوع وحدات البكسل في وسط نافذة التشغيل بينما يتم تقليل سطوع المناطق المحيطة. لاحظ أن بعض طرق التصفية لا تعمل بشكل جيد معا.

قم بتطبيق تصحيح الانجراف إذا كانت هناك حركة كبيرة للتحضير بمرور الوقت. هذه الحركة شائعة في العضلات الحية ، حتى مع إضافة الأدوية لقمع إمكانات العمل والإمكانات المتشابكة. تقوم خوارزمية تسجيل البكسل بمحاذاة صور الفاصل الزمني ويمكن أن تقلل ، ولكن عادة لا تقضي تماما على هذه الحركة.

في هذه الدراسة ، تم استخدام أربعة صور حية D للأطراف العصبية العضلية للثعبان لتحديد ما إذا كانت الجسيمات الداخلية الكبيرة أو أنا تتحرك نحو غشاء البلازما وتختفي بسرعة ، مما يشير إلى أن عددها ينخفض لأن بعضها يصل إلى الخلايا الخلوية. يتم عرض البيانات كعروض لحجم 3D في ست نقاط زمنية بفاصل إطارات يبلغ 60 ثانية. لتوضيح عمق Z لبوتون واحد ، يمكن ملاحظة أن أنا يبتعد عن المحور Y المشار إليه بالخط الأحمر المتقطع على عدة إطارات قبل أن يختفي بين النقطتين الزمنية الخامسة والسادسة ، وأن الوقت المطلوب للاختفاء كان أقل من الفاصل الزمني للإطار يتوافق مع إفراز الخلايا قبل الاختفاء مباشرة.

يبدو أن ME يقع في غشاء البلازما للهراوات. يتم عرض نفس مجموعة البيانات الأولية بعد ذلك كفيلم بتكبير أقل. يتم إيقاف التسلسل مؤقتا لفترة وجيزة في بداية كل 24 خطوة دوران ثلاثية الأبعاد حول المحور Y للفت الانتباه إلى ما سيختفي قريبا المشار إليه بالسهم الأحمر.

لاحظ أن ME مرئي يقترب من حافة البوتون ويختفي ولا يعود في جميع منظورات المشاهدة. نظرا لانخفاض دقة المحور Z مقارنة بدقة XY، يبدو أن شكل ME يطول ويقصر اعتمادا على منظور المشاهدة. أظهرت دراسات الفحص المجهري الإلكتروني أن الجسيمات الداخلية في الأطراف الحركية صغيرة الحجم بالقرب من حد حيود الضوء.

ومن ثم ، لا يمكن تمييز اندماج هذه الجسيمات الداخلية تماما عن الارتباط المكاني الوثيق على مستوى الضوء. في هذه الدراسة ، تم تصنيف Mees ب FM 1 43 المشار إليه باللون الأخضر والحمضي أو AEs تم تصنيفها بالجسيمات الليزوزومية. يتم عرض الصبغة الحيوية المشار إليها باللون الأحمر من نقطة زمنية واحدة لفيلم رباعي الأبعاد كعروض حجم ثلاثية الأبعاد في ثلاثة اتجاهات.

اللوحات العلوية من واحد إلى ثلاثة المنظر التقليدي من فوق مستوى XY. تظهر اللوحات الوسطى من أربعة إلى ستة منظرا عموديا على المستوى XY وفي اتجاه السهم الأحمر الكبير. تظهر اللوحات السفلية من سبعة إلى تسعة منظرا عموديا بشكل متبادل على كلا المنظرين أعلاه في اتجاه السهم الأزرق الكبير.

يتم تمييز Me بسهم أخضر ويتم تمييز اثنين من AEs بأسهم حمراء. لوحظت أحيانا الهياكل التي تتألق في كلا اللونين الذين يظهران باللون الأصفر في أربعة سجلات صور D. في هذا المثال ، يتم تمييز الجسيم الداخلي الذي يحتوي على كلتا الصبغتين بسهم أصفر في اللوحات الثالثة والسادسة والتاسعة.

يكتمل تداخل الأحمر والأخضر بالتساوي في جميع الإسقاطات المتعامدة الثلاثة التي تشير إلى اندماج مفترض em me ae. يعرض هذا الفيلم نفس مجموعة البيانات التي تم تكوينها للتدوير على المحور Y بمعدل إطار واحد في الثانية. يظل MEAE المنصهر المفترض أصفر من جميع وجهات النظر.

الالتفاف الرقمي أداة مفيدة لتحسين دقة الصور ثلاثية الأبعاد بالإضافة إلى أربع صور. يتم عرض مقارنة بين البيانات الأولية والبيانات المفوضة هنا. بالنسبة لطرف عصب ثعبان نموذجي ملطخ أثناء التحفيز باستخدام FM 1 43 بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 30 إلى 60 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد موقع الجسيمات الداخلية الكلية بعلامات ما قبل المشبكي.