قياس درجة الحموضة يبلوع التي كتبها Ratiometric المجهر مضان

الهدف العام من هذه المجموعة من التجارب هو قياس الأس الهيدروجيني الفاكو سومي في الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري المتري النسبة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلايا البلعمية ، مثل تحديد الجزيئات الرئيسية في تفاعلات مسببات الأمراض أو تأثير الاضطراب الجيني أو الأدوية على البلعمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه على عكس الطرق القائمة على السكان مثل الحقائق أو تأثيرات التحليل الطيفي ، مثل التغيرات في هجرة ربط الجسيمات ، أو في عدم تجانس البلعمات الفردية يمكن اكتشافها.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاجاتنا ضد الكائنات الكيميائية المسببة للأمراض لأن العديد من هذه الكائنات الحية الدقيقة يمكن أن تغير درجة الحموضة fragoso من أجل تجنب الإلهاء داخل البلعمة. لبدء هذا الإجراء ، أضف 20 ملليغرام من الزان المجفف إلى 10 ملليلتر من دوامة PBS المعقمة وقم بتسخينها في حمام مائي مغلي لمدة 10 دقائق. ثم تبرد وأجهزة الطرد المركزي عند 2000 جرام لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق Xan في مليلتر واحد من PBS. قم بتسخينه لمدة 10 دقائق في حمام مائي. ثم قم بنقل 500 ميكرولتر من Xan المعلق إلى أنبوبين سعة 1.5 مليلتر وقم بطردهما عند 11 ، 000 Gs لمدة خمس دقائق.

كرر الغسيل مع 500 ميكرولتر من PBS. ثم اغسل Xan مرتين في 500 ميكرولتر من محلول كربونات الصوديوم 0.1 مولار المحضر حديثا عند درجة الحموضة 9.3 ومعلق في 490 ميكرولتر من محلول كربونات الصوديوم بعد الغسيل النهائي. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من FZ المذاب في DMSO بمعدل 10 ملليغرام لكل مليلتر إلى دوامة Xan.

غطيها بورق احباط واحتضانها بالتحريض لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة لإزالة غسل العين غير المرتبط أولا ب 0.5 مل من DMSO بالإضافة إلى 150 ميكرولتر من PBS ، بما في ذلك صوتنة بين خطوات الغسيل. بعد ذلك ، اغسل ب 0.5 مل من DMSO بالإضافة إلى 300 ميكرولتر من PBS ، ثم اغسلها ب 0.5 مل من DMSO بالإضافة إلى 450 ميكرولتر من PBS متبوعا ب PBS وحده. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من Xan إلى 500 ميكرولتر من PBS والدوامة.

ثم أضف 10 ميكرولترات من رمل xma المخفف إلى حافة غرفة مقياس الخلوي الدموي حيث يلتقي بزلة الغطاء ، وقم بتركيب مقياس الخلوي الدموي على مجهر ساطع مجهز بهدف 20 ×. ركز على الزاوية اليسرى العليا التي تحتوي على 16 مربعا ، واحسب جميع جزيئات رمل عيد الميلاد في هذه المنطقة. باستخدام عداد إحصاء اليد ، كرر الإجراء في الزاوية اليمنى السفلية.

ثم احسب تركيز Xan باستخدام هذه المعادلة. بعد ذلك ، قم بمسح Xan المسمى بالجسم المضاد لمسعور Xan عند دوامة تخفيف من واحد إلى 100 واحتضان العينة لمدة ساعة واحدة في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بحساب رمل عيد الميلاد باستخدام مقياس الخلوي الدموي ثم تخفيفه إلى 100 مرة 10 إلى الجسيمات السادسة لكل مليلتر.

بعد عزل عدلات الفئران الأولية ، أضف ضعفين في 10 إلى خمس العدلات إلى وسط طبق سفلي زجاجي مقاس 35 ملم. ثم انشر القطرة بإضافة 50 ميكرولترا من الوسط وتحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للسماح للخلايا بالالتصاق. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من HBSS دافئا إلى 37 درجة مئوية يحتوي على مثبط بيروكسيداز النخاعي.

قم بتركيب الطبق على مجهر مضان واسع المجال ، مزود بنظام تسخين 37 درجة مئوية وهدف زيت 40 ×. احتضان الخلايا بدون تصوير لمدة 10 دقائق للسماح للخلايا والمعدات بالتوازن. بعد ذلك ، اضبط إعدادات المجهر للحصول على صورة نقل المجال الساطع مع إثارة 440 نانومتر أو 490 نانومتر وانبعاث 535 نانومتر كل 30 ثانية.

بعد دقيقتين ، أضف 10 مرات 10 إلى ستة رمل fitzy zy إلى وسط الطبق ، واستمر في التصوير لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، أوقف الحصول على الفاصل الزمني وابدأ المؤقت. حرك المسرح والتقط 10 لقطات أو أكثر في مجالات رؤية مختلفة لتصوير مناطق vaga الأخرى في غضون خمس دقائق.

في هذا الإجراء ، قم بإذابة محاليل المعايرة وتسخينها إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. تحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني وقم بتسجيله. بعد ذلك ، قم بتركيب مضخة تمعجية على الطبق السفلي الزجاجي قبل الحصول على الصورة.

ثم قم بإجراء فحص مجهري مباشر للفيديو في نهاية فترة الاستحواذ البالغة 30 دقيقة. قم بتشغيل المضخة لإزالة المحلول في الطبق. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من محلول المعايرة الأول وأوقف المضخة.

انتظر لمدة خمس دقائق حتى تستقر الإشارة. كرر الإجراء مع كل محلول معايرة. لتحليل أفلام اللقطات المتتابعة ولقطات البلعمة، افتح الصور بالصورة J.اطرح الخلفية في القناة 490 عن طريق رسم عائد استثمار مربع صغير في منطقة بدون خلايا.

باستخدام أداة تحديد المضلع المربع والنقر فوق المكونات الإضافية. ثم طرح BG بعد ذلك. حمل عائد الاستثمار نفسه على قناة 440 بالنقر فوق تعديل.

ثم التحديد متبوعا باستعادة التحديد وكرر إجراء طرح الخلفية. قم بعمل صورة بنسبة 32 بت للقناة 490 مقسومة على القناة 440 بعملية النقر الأولى. ثم حاسبة الصورة.

بعد ذلك ، حدد الصور المناسبة في الصورة الأولى والصورة القوائم المنسدلة. حدد قسمة في القائمة المنسدلة للعملية وحدد خانة الاختيار نتيجة 32 بت. بعد ذلك ، قم بتغيير جدول البحث عن الترميز اللوني إلى ترميز ألوان متوافق مع نسبة النقر فوق الصورة ، ثم الجداول لأعلى.

ثم قوس قزح RGB. قم بتعيين حد لصورة النسبة للتخلص من وحدات البكسل الصفرية واللانهائية بالنقر فوق الصورة. ثم اضبط متبوعا بالحد.

اضبط أشرطة التمرير بحيث يظهر Xan باللون الأحمر وانقر فوق تطبيق، وتأكد من تحديد خانة الاختيار تعيين وحدات بكسل الخلفية إلى nan. إذا أنتجت قيم إشارة الخلفية وإشارة Xan قيم نسبة متشابهة جدا مما يؤدي إلى صورة نسبة صاخبة ، فأضف كمية صغيرة من الخلفية إلى قناة 440 عن طريق النقر فوق العملية. ثم الرياضيات.

ثم أضف ، ثم أعد إنشاء صورة النسبة للحصول على نتيجة أنظف. بدلا من ذلك، احذف طرح الخلفية 440 قناة. بعد ذلك ، ادمج مكدس النسبة هذا مع قناة المجال الساطع في مركب متعدد القنوات بالنقر فوق لون الصورة.

ثم دمج القنوات. حدد صورة الحقل الساطع في القائمة المنسدلة للقناة الرمادية وصورة النسبة في القائمة المنسدلة للقناة الخضراء. ثم حدد خانة الاختيار الاحتفاظ بالصور المصدر.

بعد ذلك ، قم بمسح أفلام الفاصل الزمني أو اللقطات التي تقارن بين قنوات المجال الساطع والنسبة لتحديد البلعمات التي سيتم تحليلها ، وارسم عائد استثمار حول البلعمة باستخدام أداة تحديد المضلع البيضاوي وإضافتها إلى مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق أدوات التحليل. ثم مدير عائد الاستثمار ، متبوعا بإضافة لاحقا ، قم بقياس نسبة شدة Xan الخاصة بهم بالنقر فوق المزيد من القياس المتعدد وإلغاء تحديد مربع الاختيار صف واحد لكل شريحة. للأفلام ذات اللقطات المتتابعة.

تتبع مناطق FGA واحدة تلو الأخرى عن طريق رسم عنصر تحكم نوع عائد الاستثمار M لقياس كل نقطة زمنية وتحريك عائد الاستثمار عند الضرورة لتتبع قيم الشدة بمرور الوقت. ثم انسخ القياسات من نافذة النتائج إلى جدول بيانات لتحويل التألق إلى قيم الأس الهيدروجيني. بعد قياس نسبة 490 إلى 440 للبلعمات في أفلام اللقطات المتتابعة للمعايرة في جدول بيانات، ارسم قيم النسبة بمرور الوقت.

ثم احسب متوسط قيم النسبة لجميع البلعمات داخل مجال الرؤية عند خمس نقاط زمنية خلال منتصف الفترة الزمنية المقابلة لكل محلول معايرة الأس الهيدروجيني. ارسم متوسط قيم النسبة 490 إلى 440 مقابل الأس الهيدروجيني الفعلي المقاس من خلال الجمع بين ثلاث معايرات مستقلة على الأقل في رسم بياني واحد. ثم قم بإجراء تحليل الانحدار غير الخطي من أجل الحصول على معادلة لتحويل قيم النسبة إلى الأس الهيدروجيني.

يوضح هذا الشكل كيف يتم تمييز البلعمة والزان المبتلع. تعرض اللوحة اليسرى صورة ساحلية ساطعة مدمجة ونسب 490 إلى 440 Fitz zy. بينما تعرض اللوحة اليمنى صورة الحقل الساطع وحدها.

يمكن تمييز البلعمة عن الجسيمات الخارجية التي إما لا تتموضع مع الخلايا أو التي لا يتطابق تألقها مع مركز مظلم محاط بحلقة أكثر إشراقا مميزة للبلعمات في صورة الحقل الساطع المعروضة. فيما يلي الدورات الزمنية النموذجية للنوع البري و HV CN واحدة بالضربة القاضية العدلات FGA omal في العدلات من النوع البري ، أو الأس الهيدروجيني المحايد أو القلوية قليلا خلال النقاط الزمنية المبكرة بعد الابتلاع ، يمكن أن تكون البلعمة من العدلات HV CN واحدة بالضربة القاضية إما قلوية أو حمضية تجميع. تسمح اللقطات التي تم التقاطها بعد 30 إلى 35 دقيقة من إضافة الأهداف بحساب متوسط درجة الحموضة الصغيرة للسكان من عدد كبير من البلعمات في الرسوم البيانية لنسب Fitz Xan الموضحة هنا.

يمكننا أن نرى الاختلافات في درجة الحموضة الصغيرة بين النوع البري و HVCN العدلات بالضربة القاضية بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ست ساعات. بدءا من خطوة التحسين أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين ظروف التصوير. أولا ، يمكن أن يكون تحسين تركيز الجسم المضاد لخطوة التحسين مفيدا أيضا لضمان البلعمة القوية باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس إنتاج روس أو قياس قتل البكتيريا من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان الروس الصغير أو قدرة البلعمة على قتل البكتيريا قد تغيرت جنبا إلى جنب مع درجة الحموضة بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا البلعمية لاستكشاف العوامل التي تؤثر على قدرة الخلايا البلعمية على قتل أو معالجة المواد المبتلعة لاستنباط المزيد من الاستجابات المناعية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الفحص المجهري الهندسي الفلوري من أجل قياس المعلمات الفسيولوجية للبلعمات في الوقت الفعلي في الخلايا الحية.

لا تنس أن العمل مع مثبطات UNIFOR والخلايا الحية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.