التصوير في الوقت الحقيقي من النبات خلية سطح حيوية مع زاوية المتغير المجهر epifluorescence

الهدف العام من هذا الإجراء هو رصد حركة البروتينات الموسومة فلورياً على أسطح الخلايا النباتية باستخدام مجهر الفلورة فوق الخلوية بزاوية متغيرة. يمكن لهذا النهج أن يساعدنا في التقدم في مجال بيولوجيا الخلية النباتية، مثل كيفية عمل البروتينات على أسطح الخلايا النباتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح لنا تصور الديناميكيات في الوقت الفعلي للبروتينات الموسومة فلورياً قبل البدء في الإجراء.

قم بمعايرة تمركز الليزر وبؤرته في المجهر وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، استخدم مساراً ضوئياً خالياً من العدسة الشيئية لتحديد مركز سقف غرفة المجهر ووضع علامة على الموقع بختم ملون. بعد ذلك، قم بإضاءة السقف باستخدام عدسة شيئية وحرك المنطقة المضاءة إلى الموضع المركزي.

بعد ذلك، قم بتركيز الليزر وضبط موضعه بدقة ليكون في مركز السقف. إن عملية توسيط وتركيز الليزر بالغة الأهمية لنجاح الملاحظة باستخدام مجهر الإضاءة فوق الخلوية متغير الزاوية أو VAEM. يجب أن يتلقى المستخدمون تدريباً على يد موظف مختص من الشركة المصنعة للمجهر قبل البدء في التجربة.

عندما يصبح المجهر جاهزاً، ضع 30 µL من المنظم القاعدي (basal buffer) في مركز شريحة زجاجية مقاس 76 × 26 mm. بعد ذلك، استخدم مقص تشريح لإزالة co leadin من بادرة عمرها سبعة أيام، ثم ضع الـ co leadin بحيث يكون جانب المراقبة للأعلى فوق قطرة المنظم القاعدي. بعد ذلك، أضف 30 µL من المنظم القاعدي في مركز شريحة مقاس 18 × 18 mm.

ضع غطاء الشريحة ثم اقلبه رأساً على عقب. سيعمل التوتر السطحي بلطف على منع القطرة من السقوط، مع إمساك غطاء الشريحة بملقط من أحد حوافه. ضع الحافة المقابلة على الشريحة الزجاجية بحيث يكون المحلول المنظم فوق الموصل الرئيسي.

بعد ذلك، مع الحفاظ على حافة غطاء الشريحة على الشريحة، قم بتعديل موضع القطرة بحيث تكون مباشرة فوق عينة الأولين (olein) ثم أنزل غطاء الشريحة. وفي حال عدم وجود فقاعات هوائية، استخدم مناديل خالية من الوبر لمسح المحلول المنظم الزائد، وانقل التحضير فوراً إلى المجهر.

باستخدام إضاءة المجال المضيء، اختر الخلايا المراد ملاحظتها. بعد ذلك، تأكد من إمكانية ملاحظة البروتين الفلوري واستخدم إضاءة الفلورة فوق المجهرية (epi fluorescence) لضبط موضع محور Z عند سطح الخلية. ولإجراء مجهر الانبعاث الزاوي المتغير (VAEM)، استخدم صندوق التحكم لإمالة زاوية دخول شعاع الليزر.

تدريجيًا مع مراقبة الصورة الحية بعناية. في البداية، ستظهر الصورة غير واضحة. ومع زيادة زاوية الليزر، ستصبح صورة VAEM أقل تشوشًا، حتى يتم إنتاج صورة واضحة في النهاية.

عند هذه النقطة، توقف عن زيادة زاوية الليزر. الآن، قم بضبط زاوية دخول الليزر بدقة للحصول على صورة أفضل، مع تعديل معلمات البصريات ومستشعر الصورة حسب الضرورة.

ثم باستخدام برنامج المجهر التجاري، قم بالتقاط مقطع فيديو كملف صورة TIFF متعدد الصفحات. يُظهر المقطع هنا نقاطاً موسومة بـ GFP وهي تومض على سطح خلايا نموذج STA. ولتقدير زمن بقاء النقاط الموسومة بـ GFP كمياً باستخدام برنامج Fiji، انتقل إلى قائمة فتح الملفات، وافتح ملف tip متعدد الصفحات الذي تم التقاطه.

استخدم أداة تحديد الخط المستقيم لرسم خط على الجانب المراد دراسته. بعد ذلك، استخدم إضافة dynamic res slice الخاصة بمجموعات الصور (image stacks) لإنشاء صورة رسم بياني. ومع تغيير موضع الخط، ستتغير صورة الرسم البياني ديناميكيًا.

احفظ الصورة كملف TIFF من قائمة "حفظ باسم TIFF" (save as tiff). بعد ذلك، ولإجراء عملية تقليل الضوضاء، انتقل إلى قائمة "مرشحات المعالجة: التمويه الغاوسي" (process filters Gaussian blur)، وقم بتطبيق مرشح غاوسي على صور الكرونوغراف. يجب ضبط معامل نصف قطر سيجما (sigma radius) حسب الضرورة.

باستخدام أداة ضبط عتبة الصورة (image adjust threshold tool)، قم بتجزئة مناطق الإشارة عن طريق تحديد العتبة، ثم افتح قائمة ضبط قياسات التحليل (analyze set measurements menu). بعد ذلك، قم بتفعيل خيار المستطيل المحيط (bounding rectangle) في نافذة ضبط القياسات، مع اختيار أقل عدد ممكن من البكسلات. ثم انتقل إلى قائمة تحليل الجزيئات (analyze particles) ضمن قائمة التحليل (analyze).

قم بقياس وقت النقطة المراد دراستها مقابل المحور Y، وتحقق من النتائج المعروضة وأضفها إلى مربعات الإدارة لعرض قيم البيانات. وأخيراً، من قائمة جدول النتائج، اختر "ملف" (file)، ثم "حفظ باسم" (save as)، وقم بمعالجة مجموعة بيانات مدد صور النقاط باستخدام برنامج التحليل المناسب. هنا، تظهر أزمنة بقاء 185 نقطة من GFP patrol one من 12 خلية فرعية مستقلة في eighth edin كما تم قياسها بواسطة تحليل chm graph، كما هو موضح في الرسم البياني.

كشفت دالة الكثافة المجهزة أن معظم نقاط GFP patrol one كانت مقيمة في خلية مساعدة لمدة تتراوح بين 2 و 10 ثوانٍ، مع ذروة بلغت حوالي 3.5 ثانية. يشير هذا إلى عملية إخراج وإدخال خلوي سريعة لمضخات البروتونات على سطح الخلية المساعدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور وقياس ديناميكيات البروتينات من النوع ary على سطح الخلية النباتية باستخدام مجهر الفلورسنس فوق المجهري متغير الزاوية.