التصوير في الوقت الحقيقي من النبات خلية سطح حيوية مع زاوية المتغير المجهر epifluorescence
ديسمبر 12, 2015
والهدف من هذا البروتوكول هو لإظهار كيفية رصد ديناميات البروتين fluorescently الموسومة على أسطح الخلايا النباتية مع متغير الزاوية المجهر epifluorescence، والتي تبين وامض النقاط من الموسومة GFP PATROL1، وهو بروتين الاتجار الغشاء، في القشرة خلية من مجمع الثغور في نبات الأرابيدوبسيس thaliana.
الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة حركة البروتينات ذات العلامات الفلورية على أسطح الخلايا النباتية باستخدام الفحص المجهري الفلوري epi متغير الزاوية. يمكن أن يساعدنا هذا الوعاء في التقدم في مجال بيولوجيا الخلايا النباتية ، مثل كيفية عمل البروتين على أسطح الخلايا اللوحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتصور ديناميكيات الوقت الفعلي لبروتينات هجوم الفلورسنت قبل بدء الإجراء.
معايرة توسيط الليزر وتركيز المجهر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم استخدم مسار إضاءة موضوعي خال من العدسة لتحديد موقع مركز سقف غرفة الفحص المجهري وتحديد الموضع بختم ملون. بعد ذلك ، قم بإضاءة السقف بعدسة موضوعية وحرك المنطقة المضيئة إلى الوضع المركزي.
ثم قم بتركيز الليزر وضبط موضع الليزر على مركز السقف. يعد توسيط الليزر وتركيزه أمرا مهما جدا لمجهر رائحة epi متغير الزاوية الناجح أو مراقبة VAEM. يجب تدريب المستخدمين من قبل موظف محترف من شركة المجهر قبل بدء التجربة.
عندما يكون المجهر جاهزا ، قم بتوزيع 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت القاعدي على وسط شريحة زجاجية مقاس 76 × 26 ملم. ثم استخدم مقص التشريح لإزالة الرصاص المشترك من شتلة عمرها سبعة أيام وتعويم الرصاص المشترك مع جانب الملاحظة لأعلى على قطرة العازلة القاعدية. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت القاعدي إلى وسط 18 × 18 ملم.
قم بتغطية الزجاج واقلب زجاج الغطاء رأسا على عقب. سيمنع التوتر السطحي بلطف السقوط ، ويمسك زجاج الغطاء بالملاقط على حافة واحدة. ضع الحافة المقابلة على الشريحة الزجاجية بحيث يكون المخزن المؤقت فوق المدخل المشترك.
ثم احتفظ بحافة زجاج الغطاء على الشريحة. اضبط موضع القطرة بحيث تكون فوق عينة الأولين مباشرة وقم بإسقاط زجاج الغطاء. إذا لم تكن هناك فقاعات هواء ، فاستخدم مناديل خالية من النسالة لمسح المخزن المؤقت الزائد ونقل المستحضر على الفور إلى المجهر.
باستخدام إضاءة المجال الساطع ، حدد الخلايا للمراقبة. بعد ذلك ، تأكد من أنه يمكن ملاحظة البروتين الفلوري واستخدم إضاءة مضان epi لضبط موضع المحور Z على سطح الخلية. لإجراء VAEM ، استخدم صندوق التحكم لإمالة زاوية دخول شعاع الليزر.
تدريجيا أثناء مراقبة الصورة الحية بعناية. في البداية ، ستظهر الصورة غير واضحة. مع زيادة زاوية الليزر ، ستصبح صورة VAEM أقل ضبابية ، مما ينتج عنه في النهاية صورة واضحة.
في هذه المرحلة ، توقف عن زيادة زاوية الليزر. الآن بخير. اضبط زاوية دخول الليزر للحصول على صورة أفضل ، واضبط معلمات مستشعر الصور البصري حسب الضرورة.
ثم باستخدام برنامج المجهر التجاري ، احصل على فيلم كملف صورة TIFF متعدد الصفحات. هنا يظهر الفيلم نقاطا مسماة GFP تومض على سطح خلايا نموذج STA. لتحديد وقت إقامة GFP المسمى DOT باستخدام فيجي ، انتقل إلى القائمة المفتوحة للملف ، وافتح ملف التلميح متعدد الصفحات المكتس.
استخدم أداة تحديد الخط المستقيم لوضع خط على جانب الاهتمام. بعد ذلك ، استخدم المكون الإضافي لشريحة الدقة الديناميكية لمكدسات الصور لإنشاء صورة رسم بياني. مع تغير الخط ، ستتغير صورة الرسم البياني ديناميكيا.
احفظ الصورة كملف TIFF أسفل الملف ، واحفظها كقائمة tiff. ثم لإجراء تقليل التشويش ، انتقل إلى مرشحات العملية قائمة التمويه Gaussian ، وقم بتطبيق مرشح Gaussian على صور الكرونوغراف. يجب ضبط معلمة نصف قطر سيجما حسب الضرورة.
باستخدام أداة ضبط عتبة الصورة، قم بتقسيم مناطق الإشارة عن طريق تحديد العتبة وافتح قائمة تحليل مجموعة القياسات. بعد ذلك ، تحقق من المستطيل المحيط في نافذة تعيين القياسات ، وحدد الحد الأدنى لعدد وحدات البكسل الممكنة. ثم ضمن التحليل ، قم بتحليل قائمة الجسيمات.
قم بقياس وقت نقطة الاهتمام مقابل المحور Y وتحقق من نتائج العرض وأضفها إلى مربعات المدير لعرض قيم البيانات. أخيرا ، ضمن قائمة جدول النتائج ، حدد ملف ، واحفظه باسم وقم بمعالجة مجموعة بيانات فترات الصور النقطية باستخدام برنامج التحليل المناسب. هنا ، تظهر أوقات الإقامة ل 185 دورية GFP نقطة واحدة من 12 خلية فرعية مستقلة في الدين الثامن كما تم قياسها بواسطة تحليل الرسم البياني chm كما هو موضح في الرسم البياني.
كشفت وظيفة الكثافة المجهزة أن معظم النقاط الواحدة لدورية GFP كانت موجودة في خلية فرعية لمدة تتراوح بين ثانيتين و 10 ثوان مع ذروة تبلغ حوالي 3.5 ثانية. يشير هذا إلى خلوت خلوية سريعة لمضخات البروتون على سطح الخلية الفرعية. بعد العمل على هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور وقياس ديناميكيات البروتين من النوع العصبي على سطح الخلية النباتية باستخدام الفحص المجهري الفلوري epi متغير الزاوية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يوضح هذا البروتوكول مراقبة ديناميكيات البروتينات الموسومة بالفلورسنت على أسطح خلايا النبات باستخدام مجهر الفلوروفوريسنسي بزاوية متغيرة. تصور هذه التقنية نقاط توهّج لبروتينات PATROL1 الموسومة بـ GFP، وهي بروتينات مرتبطة بنقل الغشاء، في قشرة الخلية المعقدة للفواهيم في Arabidopsis thaliana.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا خلية النبات
- تقنيات المجهر
- ديناميكيات البروتين
الخلفية
- فهم حركة البروتينات على أسطح خلايا النبات أمر بالغ الأهمية لبيولوجيا النبات.
- تتيح الوسم الفلوروفوري مراقبة ديناميكيات البروتين في الوقت الحقيقي.
- يعزز مجهر الفلوروفوريسنسي بزاوية متغيرة قدرات التصور.
- يعمل Arabidopsis thaliana ككائن نموذجي لدراسات النبات.
غرض الدراسة
- لمراقبة ديناميكيات بروتينات نقل الغشاء.
- لتحسين تقنيات دراسة سلوك البروتين على أسطح الخلايا.
- للمساهمة في فهم بيولوجيا خلية النبات.
الطرق المستخدمة
- معايرة مركز الليزر وتركيز المجهر.
- استخدام مسار الضوء الحر للعدسة الموضوعية للإعداد الأولي.
- إنارة سقف غرفة المجهر لتحديد المركز.
- تصوير فوري للبروتينات الموسومة بـ GFP في خلايا النبات.
النتائج الرئيسية
- نجاح في تصور ديناميكيات PATROL1 الموسوم بـ GFP.
- تدليل على فعالية التقنية في التصوير الفوري.
- رؤى حول عمليات نقل الغشاء في خلايا النبات.
- تأسيس بروتوكول للدراسات المستقبلية في بيولوجيا خلية النبات.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة ديناميكيات البروتين.
- يعد مجهر الفلوروفوريسنسي بزاوية متغيرة أداة قيمة في بيولوجيا النبات.
- تساهم النتائج في فهم أوسع لنقل الغشاء.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Variable-angle epifluorescence microscopy (VAEM) enables real-time, high-resolution imaging of protein dynamics at the plant cell surface, providing critical insights into membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery, particularly for understanding protein localization and trafficking relevant to plant biotechnology and synthetic biology. Integrating VAEM-derived quantitative data strengthens target validation and informs translational research decisions across R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein trafficking and localization at the cell surface.
- Supports functional validation of candidate proteins involved in membrane dynamics.
- Provides quantitative residence time data for mechanistic de-risking.
- Facilitates hypothesis testing regarding protein function in cellular signaling.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging workflows for quantifying protein dynamics in live cells.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for comparative analysis.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators affecting membrane trafficking.
- Enables high-content imaging approaches for compound evaluation in plant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein trafficking data with disease-relevant or stress-response pathways in plant models.
- Provides continuity from molecular discovery to phenotypic characterization in engineered plants.
- Informs risk-adjusted advancement of synthetic biology constructs or trait engineering strategies.
- Supports translational biomarker identification through quantitative imaging outputs.
Pipeline & Workflow Integration
VAEM imaging is positioned at the interface of early discovery and assay development, enabling hypothesis-driven interrogation of protein dynamics and supporting quantitative analytics for downstream translational research.
- Discovery Biology: Facilitates real-time hypothesis testing and pathway clarification for membrane-associated proteins.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and comparative studies.
- Analytics: Generates residence time and dynamic localization data to support statistical analysis and decision-making.
- Translational Research: Bridges molecular findings to phenotypic outcomes in engineered or stress-responsive plant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform adaptable across diverse plant models and protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein trafficking studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable imaging workflows for cross-team adoption.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and constructs for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to calibrated VAEM instrumentation and compatible imaging software.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different plant species or protein targets.
- Image quality and quantitative accuracy depend on precise laser alignment and sample handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:35
Cotyledon specimen Sky Drop Mounting
2:35
Variable-angle Epifluorescence Microscopy (VAEM) Observation and Movie Acquisition
3:42
GFP-labeled Dot Residence Time Quantification by Kymograph Analysis
5:19
Results: Representative GFP-PATROL1 Dot Residence Time Analysis by Kymography
6:02
Conclusion
