تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على صور عالية الجودة أو انعكاس داخلي كلي أو مضان أو عشب للكائنات الحية الدقيقة الحاملة لجدار الخلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد زلات الغطاء والخلايا أولا. الخطوة الثانية هي محاذاة إعداد المجهر بدقة للحصول على جودة صورة مثالية.

بعد ذلك ، يتم اختيار الحوادث والزوايا وظروف التصوير الصحيحة للحصول على الصور أو الأفلام. الخطوة الأخيرة هي معالجة الصور المكتسبة بعد التصوير. في النهاية ، يتم استخدام المجهر العشب لدراسة ديناميكيات توطين البروتين في قشرة الخلية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على تجاوز المعادن مثل التقليدية أو متحدة البؤر للفحص المجهري ، هي أن تباين الصورة في الفحص المجهري إنه مرتفع جدا ، مما يسمح بأوقات سريعة وإضاءة منخفضة. على هذا النحو ، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث الأغشية ، مثل آليات فصل البروتين الجانبي ، أو حركة بروتينات الغشاء. يجب تنظيف زلات غطاء الفحص المجهري للعشب من جزيئات الغبار قبل الاستخدام.

نظرا لأن العشب حساس لإشارات الخلفية الناشئة عن الغبار على زلة الغطاء المتسخة. مطلوب زلة غطاء نظيفة بخلفية أقل لبدء إجراء تنظيف زلات الغطاء. استخدم ملقط لوضع زلات الغطاء في حامل سيراميك بغطاء.

بعد ذلك ، املأ وعاءا زجاجيا بهيدروكسيد الصوديوم المولاري. يمكن إعادة استخدام هيدروكسيد الصوديوم هذا عدة مرات. ضع حامل السيراميك الذي يحتوي على زلات الغطاء في هيدروكسيد الصوديوم واحتضن زلات الغطاء لمدة ساعتين تحت دوران مستمر بطيء.

لا تحتضن لأكثر من ثماني ساعات ، لأن هذا سيؤدي إلى انزلاق غطاء معتم بعد ساعتين ، اغسل زلات الغطاء بالماء المقطر مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة تحت دوران مستمر بطيء ، قم بتخزين زلات الغطاء النظيفة في حامل السيراميك المغطى بالإيثانول بنسبة 100٪. لتحضير الخلايا الدقيقة للعصيات لفحص العشب المجهري مخفف إلى OD 600 من 0.01 إلى 0.05 في خمسة ملليلتر من وسائط النمو المناسبة وتنمو إلى المرحلة الأسية. تحضير 1.25٪ أروس في وسط اصطناعي يذوب مسحوق الأروس في أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مليلتر عند 95 درجة مئوية ، ثم يخزن في كتلة تسخين عند 72 درجة مئوية.

أضف قطرة صغيرة من aros إلى منتصف الشريحة ومع شريحة ثانية ، اضغط على aros في وسادة مسطحة بعد دقيقتين على الأقل ، وافصل الشرائح بعناية. قم بتدوير 500 ميكرولتر من خلايا العصيات الدقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق بسرعة 12,000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في وسط 50 ميكرولتر.

أضف اثنين إلى أربعة ميكرولترات من الخلايا إلى وسط وسادة العروج. بعد ذلك ، استخدم الملقط لإزالة زلة الغطاء النظيفة من الحاوية المملوءة بالإيثانول وتجفيفها بالهواء المضغوط. ضع زلة الغطاء بعناية على العينة.

دع الخلايا تستقر لمدة دقيقتين على الأقل قبل الفحص المجهري. للتصوير طويل الأمد ، أغلق حواف زلة الغطاء بمزيج ساخن من الفازلين واللانولين والبارافين أو تطبيق Val. لتحضير الخلايا اللاصقة الخميرة للفحص المجهري العشب ، قم بتخفيف الثقافة المسبقة وتنمو في الوسائط المناسبة لمدة خمس ساعات على الأقل.

إلى المرحلة الأسية ، خذ زلة غطاء من الحاوية المملوءة بالإيثانول وجففها بالهواء المضغوط مع انتشار الماصة. خمسة ميكرولتر ، كونفال و أو يخدع محلول على الغطاء. انزلق وجفف مع الهواء المضغوط يرتبط A بالكربوهيدرات في جدار خلية الخميرة ويشل حركة خلايا الخميرة.

بعد ذلك ، قم بنقل 4.5 ميكرولتر من تعليق خلية الخميرة إلى جانب واحد من الخداع ، وهو زلة غطاء مطلي. ضع جانب عينة انزلاق الغطاء بعناية لأسفل على شريحة مجهرية تبدأ بحافة واحدة واترك القطرات ببطء. هذا سوف يتجنب تكوين فقاعات الهواء.

دع الخلايا تستقر لمدة دقيقتين على الأقل قبل الفحص المجهري ، تنزلق حواف الغلاف مع تطبيق val للتصوير طويل الأمد. يتم إجراء جميع التجارب المعروضة في هذا الفيديو على إعداد عشب مخصص يعتمد على حامل IMEX مؤتمت بالكامل مع هدف أوليمبوس 100 × 1.45 NA. مصادر الضوء المستخدمة هي 75 ملي واط أو حالة صلبة مضخة أو ليزر DPSS عند 488 نانومتر و 561 نانومتر.

زوايا العشب والتألق. يمكن تعديل التعافي بعد التبييض الضوئي أو وضع الأخوة على الفور عبر اثنين من الجلفانومتر. يتم استخدام الجلفانومتر الثالث للتبديل بين epi ، والتألق ، والfrap ، والعشب.

مقاييس الجلفانومتر ، التي يتم التحكم فيها مباشرة من برنامج الاستحواذ المباشر ، بقياس بسيط لحركية التوطين للكائنات التي يتم تتبعها في صور العشب التي يتم جمعها باستخدام كاميرا EM CCD وعدسة تكبير اثنين x أمام الكاميرا. يتم التحكم في الاستحواذ أيضا بواسطة برنامج الاستحواذ المباشر. قبل العمل مع الليزر ، ارتد نظارات أمان بالليزر ، وقم بإسقاط الليزر على السقف في وضع العشب وقم بمعايرة موضع الدرجة الصفرية بحيث يكون الليزر في خط مستقيم.

مع الهدف ، قم بتركيز بقعة الليزر على الحد الأدنى من الحجم بعد الضبط الأمثل ، يجب أن يشكل ملف تعريف الليزر بقعة محددة جيدا ذات شكل دائري تقريبا. قم بإجراء المعايرة قبل كل جلسة. للحصول على جودة الصورة المثلى ، تعد محاذاة مجهر العشب أمرا بالغ الأهمية لنجاح هذا الإجراء.

يجب ضبط الحدوث والزوايا والمعلمات الصحيحة للحصول على الصور بعناية للحصول على جودة الصورة المثلى. لبدء الحصول على الصور ، حدد موضع الخلايا باستخدام إضاءة المجال الساطع. تعتبر مصابيح LED الحمراء جيدة بشكل خاص لأنها لا تسبب أضرارا كبيرة للصور.

قم بالتبديل إلى إضاءة الليزر وحدد تركيبات الليزر والمرشحات المناسبة لإثارة الفلوروفورات التي تختارها ، وتأكد من أن زاوية العشب دون الحرجة. وإلا فلن يتم الكشف عن الإشارات الناشئة عن بروتينات اندماج GFP. أوجد الجزء العلوي من الخلية، وهو جانب الخلية المواجه لزلة الغطاء.

قم بزيادة زاوية السقوط تدريجيا لشعاع الليزر حتى تختفي الإشارات ، ثم قلل الزاوية ببطء حتى النقطة التي يظهر فيها التألق على سطح الخلية مرة أخرى. اضبط التركيز البؤري Z مرة أخرى للحصول على الوضع الأمثل على السطح. لا تخلق زوايا العشب المقبولة هالة غير واضحة على حافة الخلية كما يتضح من هذا المثال من بروتين الخميرة.

تصوير PMA one GFP بزوايا سقوط متناقصة من أعلى اليسار إلى أسفل اليمين. تظهر الصور فقدانا مفاجئا للإشارة عند الزاوية الحرجة وانخفاضا تدريجيا في المعلومات الهيكلية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء ، وضبط شدة الليزر وكسب الكاميرا لزيادة النطاق الديناميكي. عادة ما تكون كاميرات E-M-C-C-D مثالية لاكتشاف الإشارات المنخفضة جدا بنسب إشارة إلى ضوضاء عالية.

الفحص المجهري للعشب حساس للغاية للارتفاع الصغير. تؤدي الاختلافات في زلة الغطاء إلى عدد قليل من الخلايا التي يمكن تصويرها في نفس الوقت. هذه الصورة للتعليق الكثيف لخرز الفلورسنت هي مثال على مجال رؤية غير متساو حيث يكون جزء فقط من مجال الرؤية في بؤرة التركيز.

لذلك ، بالنسبة للخلايا الصغيرة ، يمكن غالبا تقليل منطقة الاستحواذ إلى منطقة فرعية تحتوي على الكائن المفضل. بالنسبة لتجارب العشب ذات اللون المزدوج ، يجب تقليل النزيف من خلال الفلوروفورات لأزواج R-F-P-G-F-P. استخدم مرشحات انبعاث منفصلة حيث يتم تحفيز RFP أسبوعيا بضوء 488 نانومتر.

عرض سير عمل نموذجي لتجنب النزيف والتصوير بالألوان المزدوجة هنا. بعد تصوير الخلايا بمجموعات مرشحات منفصلة ، يتم تفويض الصور ومحاذاتها باستخدام حبات الفلورسنت قبل دمجها للتحليل ، فإن المعلمة الحاسمة التي تؤثر على جودة الصورة هي محاذاة الليزر والهدف النظيف. بعد محاذاة الليزر والتركيز على الموضع Z المستخدم لتصوير العشب ، قم بإزالة العينة وتنظيف الهدف من كل الزيت.

سيؤدي الزيت المتبقي إلى حيود ضوء الليزر والبقع في ملف تعريف الحزمة. يمكن استخدام الفحص المجهري للعشب لتصور توزيع متماثلات الأكتين وإنزيمات جدار الخلية في الخلايا البكتيرية. في هذه النتيجة التمثيلية ، تم تصوير الخلايا الدقيقة للعصيات التي تعبر عن اندماجات GFP من طوق الأكتين MBL أو ترانسببتيداز PBPH بواسطة العشب والتألق المنتظم epi

تمثل الصور هنا متوسط الإسقاطات لسلسلة زمنية للإشارة إلى المنطقة التي تغطيها المتحركة. يتم مراقبة تصحيحات MBL بأوضاع تصوير مختلفة. يشير المخطط الأزرق في صورة التراكب إلى حدود الخلية المرئية من صورة الحقل الساطع.

يتم توطين transpeptidase PBPH المعبر عنه أسبوعيا في البقع القشرية التي يصعب رؤيتها بواسطة مضان epi ، ولكن يمكن تمييزها بوضوح عن طريق العشب. يمكن ملاحظة الاختراق المنخفض بشكل أفضل لإشارة P-B-P-H-G-F-P في SEPTA المشار إليها بواسطة الأسهم ، والتي تظهر كخطوط في مضان epi ، ولكن كنقاط في العشب. تظهر هذه المجموعة التالية من الصور مقارنة بين مضان epi وإضاءة العشب لمكون TOR المركب ، البت 61 في Saccharomyces visi.

يتم التعبير عن هذا البروتين أسبوعيا ويشكل رقعا قشرية صغيرة مع عدد قليل من نسخ البروتين لكل رقعة. في التألق epi ، لا تظهر سوى عدد قليل من البقع فوق الخلفية القوية بينما يمكن تصوير البقع بإشارة جيدة جدا إلى نسبة الضوضاء في العشب. يمكن الحصول على تحسين إضافي لتباين الصورة من خلال خطوات معالجة الصور المختلفة ، مثل طرح الصور الغوسية أو المتوسطة غير الواضحة بينما يزيل طرح الخلفية المحلية الضوضاء ويزيد من حدة الهياكل عالية الكثافة.

غالبا ما يأتي هذا على حساب فقدان الهياكل الدقيقة والتضخيم المبالغ فيه للمناطق عالية الكثافة. كما هو موضح في السهم ، فإن الإجراء المتفوق هو التفكيك ثنائي الأبعاد ، والذي يمكن إجراؤه باستخدام حزم البرامج المجانية أو المتاحة تجاريا. يتضح الارتفاع في التباين بعد الالتفاف من خلال هذا الفيلم بفاصل زمني من GFP RAs two الذي يعرض صورا متناوبة للعشب الخام والمفوض.

نظرا لأن GFP RAs two هو بروتين سريع الحركة ، فمن المهم حل أوقات الاستحواذ السريعة. سلوكها الديناميكي. تعد معالجة الصور مهمة بشكل خاص لتحليلات التحديد المشترك كما هو موضح في هذا الفيلم ذو الفاصل الزمني مزدوج اللون لبروتينات الخميرة و FET 3G FP و PMA one RFP.

تمثل الإطارات العشرة الأولى صورا أولية والإطارات المتبقية عبارة عن صور مفوضة لجعل التحليل ممكنا ، من الأهمية بمكان زيادة التباين وشحذ الصور الأولية الباهتة. يوفر العشب والفراب مزيجا قويا لدراسة ديناميكيات البروتينات القشرية. استبعد استخدام هذه التقنية في الخلايا البائية الدقيقة التي تعبر عن G-F-P-M-B-L جهاز المشي كآلية للحركة الملحوظة لبقع MBL المحتوية.

الرسم البياني chm للرقعة المتحركة وملف تعريف الشدة على طول الرسم البياني chm المشار إليه بواسطة الخط المنقط بطريقة مماثلة لغشاء بلازما الخميرة. كشف TPAs PMA واحد عن إعادة الترتيب البطيئة لبروتينات غشاء البلازما الخميرة ، والتي توزع في شبكة مثل المجالات التي تغطي سطح الخلية بالكامل بعد تطورها. مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث في مجال بيولوجيا الخلية البكتيرية لاستكشاف آلية تخليق جدار الخلية في BA subtilis.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على صور العشب للكائنات الحية الدقيقة مثل الخميرة والبكتيريا ، وكيف يمكن أن تساعد هذه التقنية في دراسة الخصائص الديناميكية للبروتينات القشرية.