تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على صور عالية الجودة ذات انعكاس داخلي كلي، أو صور فلورية، أو صور "turf" للكائنات الدقيقة التي تمتلك جداراً خلوياً. يتم تحقيق ذلك من خلال تحضير الشرائح الغطائية والخلايا أولاً، ثم تأتي الخطوة الثانية المتمثلة في ضبط محاذاة إعدادات المجهر بدقة لضمان الحصول على أفضل جودة للصورة.

بعد ذلك، يتم اختيار الحوادث والزوايا وظروف التصوير الصحيحة لالتقاط الصور أو المقاطع المرئية. وتتمثل الخطوة النهائية في المعالجة البعدية للصور التي تم الحصول عليها. وفي نهاية المطاف، يُستخدم مجهر العشب (turf microscopy) لدراسة ديناميكيات تموضع البروتين عند قشرة الخلية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالمعادن المتجاوزة مثل المجهر التقليدي أو المجهر البؤري في أن تباين الصورة في المجهر عالٍ جداً، مما يسمح بتقليل الأوقات وخفض شدة الضوء. وبناءً على ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال أبحاث الغشاء، مثل آليات الفصل البروتيني الجانبي، أو حركية بروتينات الغشاء. يجب تنظيف شرائح التغطية المستخدمة في المجهر من جزيئات الغبار قبل الاستخدام.

بما أن تقنية التركيز الموجه (turf) حساسة للإشارات الخلفية الناتجة عن الغبار الموجود على شريحة غطاء متسخة، فإن الأمر يتطلب شريحة غطاء نظيفة ذات خلفية أقل لبدء إجراء تنظيف شرائح الغطاء. استخدم ملقطًا لوضع شرائح الغطاء في حامل خزفي مزود بغطاء.

بعد ذلك، املأ وعاءً زجاجيًا من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز مولار واحد. يمكن إعادة استخدام هيدروكسيد الصوديوم هذا لعدة مرات. ضع الحامل الخزفي الذي يحتوي على شرائح التغطية في هيدروكسيد الصوديوم، واترك شرائح التغطية في الحاضنة لمدة ساعتين مع التدوير المستمر والبطيء.

لا تترك العينات في الحاضنة لأكثر من ثماني ساعات، لأن ذلك سيؤدي إلى تكوّن شرائح غطاء معتمة بعد مرور ساعتين؛ اغسل شرائح الغطاء بالماء المقطر مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة مع التدوير المستمر والبطيء، ثم خزن شرائح الغطاء النظيفة في الحامل الخزفي مغمورة في 100% ethanol. ولتحضير خلايا bacillus subtlest للفحص المجهري، خفف المحلول حتى تصل قيمة OD 600 إلى 0.01 إلى 0.05 في خمسة مليلترات من وسط نمو مناسب، ثم اتركها تنمو حتى تصل إلى الطور الأسي. ولتحضير 1.25% aros في وسط اصطناعي، أذب مسحوق aros في أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مليلتر عند 95 °C، ثم خزن الأنبوب في كتلة تسخين عند 72 °C.

أضف قطرة صغيرة من aros إلى منتصف شريحة، وباستخدام شريحة ثانية، اضغط على aros لتشكيل طبقة مسطحة بعد مرور دقيقتين على الأقل، ثم افصل الشريحتين بعناية. قم بتدوير 500 µL من خلايا bacillus subtlest في جهاز طرد مركزي دقيق بسرعة 12,000 RPM لمدة دقيقة واحدة. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 50 µL من الوسط الزرعي.

أضف من 2 إلى 4 µL من الخلايا إلى مركز وسادة aros. بعد ذلك، استخدم الملاقط لإزالة شريحة غطاء نظيفة من الحاوية المملوءة بالإيثانول وجففها باستخدام الهواء المضغوط. ضع شريحة الغطاء بعناية فوق العينة.

اترك الخلايا تستقر لمدة دقيقتين على الأقل قبل الفحص المجهري. وبالنسبة للتصوير طويل الأمد، قم بإغلاق حواف غطاء الشريحة باستخدام المزيج المسخن من الفازلين واللانولين والبارافين أو Val app. ولتحضير خلايا Saccharomyces visi للفحص المجهري، قم بتخفيف مزرعة أولية وزراعتها في أوساط مناسبة لمدة خمس ساعات على الأقل.

للوصول إلى المرحلة الأسية، خذ شريحة غطاء من الحاوية المملوءة بالإيثانول وجففها باستخدام الهواء المضغوط بواسطة ناشر الماصة. ضع 5 µL من محلول Con A على شريحة الغطاء وجففها بالهواء المضغوط؛ حيث يرتبط Con A بالكربوهيدرات الموجودة في جدار خلية الخميرة ويعمل على تثبيت خلايا الخميرة.

بعد ذلك، انقل 4.5 µL من معلق خلايا الخميرة إلى أحد جوانب الغطاء الساتر المطلي. ضع الغطاء الساتر بعناية بحيث يكون جانب العينة للأسفل على شريحة مجهرية، بدءًا من أحد الحواف ثم تركه ينخفض ببطء؛ وذلك لتجنب تكون فقاعات هوائية.

اترك الخلايا تترسب لمدة دقيقتين على الأقل قبل الفحص المجهري، ثم قم بإغلاق حواف غطاء الشريحة باستخدام val app للتصوير طويل المدى. جميع التجارب المعروضة في هذا الفيديو تم إجراؤها باستخدام إعداد turf مخصص يعتمد على حامل IMEX مؤتمت بالكامل مع عدسة شيئية Olympus 100 x 1.45 NA. مصادر الضوء المستخدمة هي ليزرات الحالة الصلبة التي يتم ضخها بالديود (DPSS) بقدرة 75 milliwatt عند 488 nanometers و 561 nanometers.

زوايا Turf والفلورة. يمكن ضبط الاستعادة بعد التبييض الضوئي أو موضع FRAP فورياً عبر جلفانومترين. ويستخدم جلفانومتر ثالث للتبديل بين الإضاءة فوق الخلوية (epi)، والفلورة، وFRAP، وTurf.

تتيح الجلفانومترات، التي يتم التحكم فيها مباشرة من خلال برنامج الحصول على البيانات المباشر، قياساً بسيطاً لحركية التمركز للأجسام التي يتم تتبعها في صور العشب التي يتم جمعها باستخدام كاميرا EM CCD وعدسة تكبير بمقدار مرتين أمام الكاميرا. كما يتم التحكم في عملية الحصول على البيانات بواسطة برنامج الحصول على البيانات المباشر. قبل العمل بالليزر، ارتدِ نظارات السلامة الخاصة بالليزر، وقم بتسليط الليزر على السقف في وضع العشب، وعاير موضع الصفر بحيث يكون الليزر في خط مستقيم.

بهدف تحقيق الغرض، قم بتركيز بقعة الليزر إلى أقل حجم ممكن بعد الضبط الأمثل، ويجب أن يشكل ملف الليزر بقعة محددة جيداً وذات شكل دائري تقريباً. قم بإجراء المعايرة قبل كل جلسة. وللحصول على جودة صورة مثالية، يعد محاذاة مجهر العشب أمراً بالغ الأهمية لنجاح هذا الإجراء.

يجب ضبط السقوط والزوايا والمعاملات الصحيحة للحصول على الصور بدقة لضمان الحصول على أفضل جودة للصورة. لبدء عملية الحصول على الصور، حدد موقع الخلايا باستخدام إضاءة المجال المضيء (brightfield). وتُعد مصابيح LED الحمراء جيدة بشكل خاص لأنها لا تسبب ضرراً ضوئياً ملحوظاً.

قم بالتحويل إلى الإضاءة بالليزر واختر مجموعات الليزر والمرشحات المناسبة لإثارة الفلوروفورات المختارة، وتأكد من أن زاوية السقوط دون الحرجة. وإلا فلن يتم اكتشاف الإشارات الناشئة عن بروتينات الاندماج GFP. حدد القسم العلوي من الخلية، وهو جانب الخلية المواجه للشريحة الغطائية.

قم بزيادة زاوية سقوط شعاع الليزر تدريجياً حتى تختفي الإشارات، ثم قم بتقليل الزاوية ببطء حتى النقطة التي يظهر فيها التألق الفلوري مجدداً عند سطح الخلية. أعد ضبط تركيز المحور Z للحصول على الوضع الأمثل عند السطح. إن زوايا السطح المقبولة هي التي لا تسبب ظهور هالة ضبابية عند حافة الخلية، كما هو موضح في هذا المثال لبروتين الخميرة.

تصوير PMA one GFP مع تقليل زوايا السقوط من أعلى اليسار إلى أسفل اليمين. تُظهر الصور فقدانًا مفاجئًا للإشارة عند الزاوية الحرجة وانخفاضًا تدريجيًا في المعلومات الهيكلية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء؛ قم بضبط شدة الليزر وكسب الكاميرا لزيادة المدى الديناميكي إلى أقصى حد. عادةً ما تكون كاميرات E-M-C-C-D مثالية للكشف عن الإشارات المنخفضة جدًا بنسب إشارة إلى ضوضاء عالية.

تعتبر مجهرية العشب حساسة للغاية للاختلافات الطفيفة في الارتفاع. وتؤدي الاختلافات في غطاء الشريحة إلى إمكانية تصوير عدد قليل فقط من الخلايا في وقت واحد. وتعد هذه الصورة لمعلق كثيف من الخرزات الفلورية مثالاً على مجال رؤية غير مستوٍ، حيث يكون جزء فقط من مجال الرؤية في بؤرة التركيز.

وبناءً على ذلك، يمكن في حالة الخلايا الصغيرة تقليل منطقة الالتقاط غالباً إلى منطقة فرعية تحتوي على الجسم المراد دراسته. وبالنسبة لتجارب تتبع الخلايا (turf) ثنائية اللون، يجب تقليل تداخل الفلوروفورات إلى أدنى حد لأزواج R-F-P-G-F-P. استخدم مرشحات انبعاث منفصلة لأن RFP يتم استثارته بشكل ضعيف بواسطة الضوء بطول موجي 488 nanometer.

يظهر هنا سير العمل النموذجي لتجنب النفاذ اللوني والتصوير المزدوج للألوان. بعد تصوير الخلايا باستخدام مجموعات مرشحات منفصلة، يتم إلغاء التفاف الصور ومحاذاتها باستخدام حبيبات فلورية قبل دمجها. ولأغراض التحليل، يعد محاذاة الليزر ونظافة العدسة الشيئية من المعايير الحاسمة التي تؤثر على جودة الصورة. بعد محاذاة الليزر والتركيز على موضع Z المستخدم لتصوير العشب، قم بإزالة العينة وتنظيف العدسة الشيئية من جميع آثار الزيت.

تؤدي بقايا الزيت إلى حيود ضوء الليزر وظهور بقع في ملف الشعاع. يمكن استخدام مجهر Turf لتصور توزيع متجانسات الأكتين وإنزيمات الجدار الخلوي في الخلايا البكتيرية. وفي هذه النتيجة التمثيلية، تم تصوير خلايا bacillus subtles التي تعبر عن اندماجات GFP لـ actin hoog MBL أو ترانسببتيداز PBPH باستخدام تقنيتي turf و epi fluorescence العادية.

تمثل الصور هنا متوسطات إسقاطات لسلسلة زمنية للإشارة إلى المنطقة التي تغطيها بقع MBL المتحركة التي تمت مراقبتها باستخدام أنماط تصوير مختلفة. يشير الإطار الأزرق في الصورة المتراكبة إلى حدود الخلية التي تم تصورها من صورة الحقل المضيء.

يتمركز إنزيم الترانسبيبتيداز PBPH الذي يتم التعبير عنه أسبوعياً في رقع قشرية تكاد تكون غير مرئية بواسطة مجهر الفلورة فوق البؤري (epi fluorescence)، ولكن يمكن تمييزها بوضوح بواسطة تقنية turf. ويمكن ملاحظة تراجع الاختراق بشكل أفضل لإشارة P-B-P-H-G-F-P عند SEPTA المشار إليها بالأسهم، والتي تظهر كخطوط في مجهر الفلورة فوق البؤري، ولكن كنقاط في تقنية turf. وتظهر مجموعة الصور التالية مقارنة بين إضاءة مجهر الفلورة فوق البؤري وإضاءة turf لمكون معقد TOR، وهو bit 61 في Saccharomyces visi.

يُعبَّر عن هذا البروتين بشكل ضعيف، وهو يشكل بقعاً قشرية صغيرة تحتوي على عدد قليل فقط من نسخ البروتين في كل بقعة. في مجهر الفلورسنت فوقي الإثارة (epi fluorescence)، تظهر بقع قليلة فقط فوق الخلفية القوية، بينما يمكن تصوير البقع بنسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة جداً باستخدام تقنية turf. ويمكن تحقيق تحسين إضافي في تباين الصورة من خلال خطوات معالجة الصور المختلفة، مثل طرح الصور ذات التمويه الغاوسي (Gaussian) أو التمويه الوسيط (median)، بينما يعمل طرح الخلفية المحلية على إزالة الضوضاء وشحذ الهياكل ذات الكثافة العالية.

غالباً ما يكون ذلك على حساب فقدان البنى الدقيقة وتضخيم مبالغ فيه للمناطق ذات الكثافة العالية. وكما يشير السهم، فإن الإجراء الأفضل هو إزالة الالتفاف ثنائية الأبعاد (2D deconvolution)، والتي يمكن إجراؤها باستخدام حزم برمجيات مجانية أو متوفرة تجارياً. ويتضح تزايد التباين بعد عملية إزالة الالتفاف من خلال هذا المقطع المرئي بنظام التصوير الزمني لـ GFP RAs two الذي يعرض صوراً متبادلة بين الصور الخام وصور Turf التي خضعت لإزالة الالتفاف.

بما أن البروتين GFP RAs two هو بروتين سريع الحركة، فإن أوقات الحصول على الصور السريعة ضرورية لتحليل سلوكه الديناميكي. وتكتسب معالجة الصور أهمية خاصة في تحليلات التوضع المشترك، كما هو موضح في هذا الفيلم الملون المزدوج بنظام التصوير المتقطع لبروتينات الخميرة، FET 3G FP، و PMA one RFP.

تمثل الإطارات العشرة الأولى صوراً خاماً، بينما تمثل الإطارات المتبقية صوراً مفكوكة الالتفاف. ولجعل التحليل ممكناً، من الضروري زيادة التباين إلى أقصى حد وشحذ الصور الخام الضبابية. يوفر تقنيتا Turf و frap مزيجاً قوياً لدراسة ديناميكيات البروتينات القشرية. وباستخدام هذه التقنية في خلايا B subtlest التي تعبر عن G-F-P-M-B-L، تم استبعاد عملية treadmilling كآلية للحركية الملحوظة للرقع التي تحتوي على MBL.

يظهر الرسم البياني لـ chm للبقعة المتحركة ومخطط الكثافة على طول رسم chm البياني المشار إليه بالخط المنقط بطريقة مماثلة لـ turf frap للغشاء البلازمي للخميرة. كشف TPAs PMA one عن إعادة الترتيب البطيئة لبروتينات الغشاء البلازمي للخميرة، والتي تتوزع في نطاقات تشبه الشبكة تغطي سطح الخلية بالكامل بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث في مجال بيولوجيا الخلية البكتيرية لاستكشاف آلية تخليق جدار الخلية في B. subtilis.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على صور "Turf" للكائنات الحية الدقيقة مثل الخميرة والبكتيريا، وكيف يمكن لهذه التقنية أن تساعد في دراسة الخصائص الديناميكية للبروتينات القشرية.