تحسين 2D و 3D الجلد في المختبر نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام

الهدف العام من هذا الإجراء هو تعزيز ترسب المصفوفة خارج الخلية وتحسين نماذج الجلد الحالية ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد باستخدام الازدحام الجزيئي الكبير. يحسن الازدحام توليد المصفوفات المشتقة من الخلايا ، والثقافات العضوية الناضجة في إطار زمني مكثف. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الأنسجة لأنها توفر طرقا محسنة لتوليد مصفوفات خارج الخلية المشتقة من الخلايا للهندسة الحيوية للجلد والأنسجة الأخرى.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إنشاء المصفوفات المشتقة من الخلايا وتركيبات الجلد العضوية في إطار زمني مكثف بشكل كبير عند تطبيق الازدحام الجزيئي على هذه الثقافات. تتيح لك تقنية الفحص المجهري لانعكاس التداخل تصور ترسب المصفوفة خارج الخلية الكلي دون الحاجة إلى تلطيخ الأجسام المضادة. ستمتد تطبيقات هذه التقنيات من دراسات ترسب المصفوفة خارج الخلية بواسطة خلايا الجلد إلى علاجات الجروح المحسنة ، خاصة مع توليد مكافئات جلدية أفضل وزراعة الأنسجة للتطعيم.

للبدء ، قم بزرع 50،000 من الخلايا الليفية الأولية ، أو الخلايا الكيراتينية الأولية ، أو ثقافة مشتركة لكليهما ، في مليلتر واحد من بئر متوسط ، في آبار صفيحة 24 بئرا. اسمح للخلايا بالالتصاق بحاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، تخلص من الوسط القديم واستبدله بمليلتر واحد من الوسط الطازج الذي يحتوي على حشود جزيئية كبيرة وحمض الأسكوربيك 100 ميكرومولار.

احتضان الثقافات لمدة ستة أيام ، وقم بتغيير الوسط كل يومين. إجراء التألق المناعي والنشاف الغربي وفقا لبروتوكول النص. لإنشاء واستخدام مصفوفة مشتقة من الخلية ، بعد زراعة الخلايا لمدة ستة أيام باستخدام الزحام الجزيئي وحمض الأسكوربيك كما هو موضح للتو ، قم بإزالة الخلايا من طبقات الخلية للحصول على مصفوفة مشتقة من الخلية باستخدام 1X PBS أولا لغسل طبقات الخلية مرتين.

استنشق PBS ، ثم أضف 250 ميكرولتر من 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق. قم بشفط محللة الخلية ، ثم أضف 250 ميكرولتر إضافيا من 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم وكرر الحضانة والشفط لمدة 10 دقائق مرتين أخريين. استخدم الماء المقطر لغسل المصفوفة المشتقة من الخلية مرتين.

استنشق الماء ، ثم أضف 1X PBS. قم بتخزين المصفوفة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. لتحضير تعليق الخلية الثانوية ، قم بشفط PBS من المصفوفة ، وقم بزرع 50،000 من الخلايا الكيراتينية أعلى حصيرة F على سبيل المثال.

اسمح للخلايا بالالتصاق طوال الليل. لإجراء الفحص المجهري لانعكاس التداخل ، أو RIM ، على مصفوفة مشتقة من الخلية ، قم بإجراء الحصول على الصور باستخدام مجهر موضعي البؤرة وفقا لبروتوكول النص. لصب هلام الكولاجين مع الخلايا الليفية المغلفة في إدراج ثقافة الخلية ، قم بتناول 10 ملليلتر من كولاجين ذيل الفئران من النوع الأول في دورق بارد.

أضف ملليلترا واحدا من DMEM البارد و 0.5 مل من هيدروكسيد الصوديوم المولي لتحييد الكولاجين الحمضي. ثم أضف 0.5 مل من تعليق الخلايا الليفية. باستخدام ماصة باردة ، قسم 12 مل من المحلول بالتساوي إلى إدخالات لزراعة الخلايا في صفيحة ثقافة من ستة آبار.

احتضان الجل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بمجرد أن يصلب الجل ، اغمره في وسط الخلايا الليفية أو FM. ثم بعد احتضانه لمدة 24 ساعة ، قم بشفط FM. استخدم أربعة ملليلتر من الوسط الطازج الذي يحتوي على حشد جزيئي كبير لاستبدال FM القديم عن طريق إضافة ملليلترين إلى الجزء الداخلي من إدراج ثقافة الخلية ومليلترين إلى الجزء الخارجي من إدراج ثقافة الخلية. بعد حضانة لمدة 24 ساعة ، استخدم عامل غش التربسين بنسبة 0.125٪ لتجربة الخلايا الكيراتينية.

اضغط على جوانب القارورة برفق لإخراج الخلايا وإضافة وسيط يحتوي على مصل لتحييد التربسين. بعد عد الخلايا ، قم بإعداد تعليق الخلايا الكيراتينية. بعد ذلك ، قم بشفط الوسط من إدخالات ثقافة الخلايا ، وأضف الخلايا الكيراتينية إلى الجزء العلوي من الجل.

احتضن الجل لمدة ساعة واحدة. بعد أن تلتصق الخلايا الكيراتينية بسطح الهلام ، استخدم ملليلترين من KSFM ، أو CTN-57 وسيط خال من المصل لغمر الخلية داخل إدراج ثقافة الهلام وإضافة ملليلترين من FM إلى الجزء الخارجي من إدراج ثقافة الخلية. بعد حضانة لمدة 24 ساعة ، تخلص من الوسط القديم واستبدله بوسط جديد يحتوي على حشد جزيئي كبير.

بعد سبعة أيام في الثقافة المغمورة ، لرفع المزرعة إلى واجهة هواء سائلة ، انقل إدراج المزرعة إلى صفيحة بئر عميقة. أضف 10 ملليلتر من وسط التقسيم الطبقي إلى الجزء الخارجي من إدراج ثقافة الخلية ، مع الحفاظ على الجزء الداخلي من الملحق جافا. أخيرا ، احتضان الثقافات وقم بتغيير الوسط كل ثلاثة أيام لمدة 14 يوما.

حصادها ومعالجتها وفقا لبروتوكول النص. كما هو موضح هنا ، سمح الازدحام الجزيئي للخلايا الليفية بإيداع المزيد من المصفوفة خارج الخلية أو ECM مقارنة بثقافات التحكم. عند العلمنة ، كان من الواضح أن الخلايا الليفية كانت المودعين الرئيسيين للكولاجين الأول والكولاجين الرابع والفيبرونكتين.

يوضح هذا الرقم أن الخلايا الليفية بدلا من الخلايا الكيراتينية التي كانت المودعين الرئيسيين للكولاجين سبعة ، وهذا هو التقرير الأول عن ترسيب الكولاجين السابع الناجح في المختبر. باستخدام RIM ، تم التقاط المدى الكامل للمصفوفة المشتقة من الخلية. يظهر تراكب صورة RIM مع تلطيخ الجسم المضاد الكمية النسبية لمكون ECM هذا فيما يتعلق بالكمية الإجمالية ل ECM.

في نموذج الجلد ثلاثي الأبعاد في المختبر ، أدى الازدحام الجزيئي أو MMC ، إلى تقصير وقت الثقافة من خمسة أسابيع إلى ثلاثة أسابيع ، للحصول على ثقافة بشرية عضوية ناضجة. كما هو موضح هنا ، من خلال تلطيخ H و E ، في ثلاثة أسابيع ، تتكون الثقافة مع MMC من بشرة جنبية وأدمة ريدج سترمول. بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن الكولاجين المكثف والمستمر سبعة immnunostaining عند تقاطع البشرة الجلدية لمزارع الخلايا المزدحمة مقارنة بالكولاجين الضعيف والمتقطع سبعة تلطيخ مناعي في ثقافات التحكم.

يظهر الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال أيضا وجود ألياف مثبتة في الثقافات العضوية المتولدة باستخدام MMC ، مما يدل على الكولاجين الوظيفي سبعة. يمكن استخدام المصفوفات المشتقة من الخلايا لأغراض بذر الخلايا الثانوية كسقالة بديلة حيث يتم الحفاظ على تعقيد المصفوفة خارج الخلية ، ويتم إنتاجها بواسطة الخلايا نفسها. يمكن استخدام ثقافات الجلد العضوية ، التي يتم إنشاؤها في ظل الازدحام الجزيئي ، كنموذج محسن للجلد ثلاثي الأبعاد لأنه يحتوي على أدمة لحمية ، وتقاطع جلدي رئيسي ، وبشرة

يمكن أيضا استخدام الثقافات العضوية أو المكافئة للجلد التي تم إنشاؤها باستخدام الحظام الجزيئية الكبيرة لتطعيم الجلد لأن لديهم مصلة جلدية بشرية متطورة بشكل أفضل ، والتي من المحتمل أن تحسن نجاح الكسب غير المشروع. بالإضافة إلى ترسب المصفوفة خارج الخلية المعزز ، يمكن تطبيق الازدحام الجزيئي على أنظمة المختبر الأخرى لتعزيز التفاعلات ذات المعدل المحدود ، دون الحاجة إلى زيادة كمية الكواشف. على سبيل المثال ، تفاعلات البوليميراز المتسلسلة.