النمذجة العلاج الكيميائي اللوكيميا المقاومة في المختبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو نمذجة أفضل لابيضاض الدم الليمفاوي الحاد المقاوم ، أو ALL ، في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علاج ابيضاض الدم اللمفاوي الحاد المقاوم للحرارة حول كيفية تأثير البيئة المكروية لنخاع العظم على مقاومة العلاج الكيميائي لخلايا الدم اللمفاوي الحاد. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها أرخص بكثير وأقل استهلاكا للوقت من استخدام النماذج الحيوانية التقليدية لفحص الدفاع عن المخدرات على خلايا ابيضاع الدم ابيضاعي الدم الابيضاعي الحاد المقاومة للحرارة.

ابدأ بزرع خمسة إلى 20 مرة من 10 إلى خلايا ابيضاض الدم السادسة في 10 ملليلتر من وسط الثقافة الخاص بالورم على صفيحة 100 ملم من 80 إلى 90٪ من الخلايا اللحمية لنخاع العظم أو بانيات العظم. كل أربعة أيام ، قم بإمالة اللوحة إلى الجانب واستنشق كل مليلتر من الوسط باستثناء مليلتر واحد ، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة الخلية الملتصقة. بعد ذلك ، أضف بعناية تسعة ملليلتر من وسط زراعة خلايا اللوكيميا الطازجة بالتنقيط في زاوية اللوحة على طول الجانب لضمان الحد الأدنى من اضطراب الخلايا الملتصقة.

بعد اليوم الثاني عشر من الزراعة المشتركة ، قم بعمل ماصة وسط المزرعة برفق لأعلى ولأسفل فوق اللوحة حوالي خمس إلى 10 مرات لجمع خلايا سرطان الدم العائمة. ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، أعد زرع الخلايا على صفيحة جديدة من 80 إلى 90٪ من الخلايا اللحمية لنخاع العظم المتقاربة ، أو بانيات العظم ، كما هو موضح للتو.

بحلول اليوم الرابع ، ستكون ثلاث مجموعات سكانية فرعية من خلايا سرطان الدم قد تشكلت ، مع تطفو خلايا سرطان الدم العالقة بحرية في الوسط. تلتصق خلايا سرطان الدم Phase Bright بسطح الطبقة الأحادية للخلية الملتصقة ، وهاجرت خلايا سرطان الدم الخافتة تحت الطبقة الأحادية. لتحضير أعمدة حبة G10 ، قم أولا بإعادة تسخين 30 مل من وسط زراعة الخلايا لكل عمود إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لسحب الصوف الزجاجي إلى خيوط رفيعة وفضفاضة. وأضف طبقات متعددة من الخيوط المعبأة قليلا إلى حقنة واحدة سعة 10 ملليلتر لكل عمود مطلوب. عندما تكون المحقنة ممتلئة بمقدار 2/3 ، قم بإرفاق محبس أحادي الاتجاه في الوضع المغلق بالطرف ، وقم بتثبيت المحقنة على حامل حلقي مرتفع بما يكفي بحيث يمكن وضع أنبوب تجميع مخروطي سعة 50 مليلتر أسفل محبس.

الآن ، ضع أنبوب تجميع أسفل عمود المحقنة. واستخدم ماصة سعة 10 مليلتر لإضافة قطرات من جزيئات G10 معلقة في PBS فوق الصوف الزجاجي. استمر في إضافة جزيئات G10 حتى تتشكل حبيبات ملليلتر.

ثم أضف حصتين من المليلتر من الوسط الدافئ مسبقا إلى العمود. وافتح صمام محبس التثبيت ببطء ، بحيث يتدفق الوسيط من العمود بالتنقيط. عندما يتم تصريف 10 مل من الوسط بالكامل من خلال العمود ، أغلق المحبس.

تخلص من التدفق ، وضع أنبوب تجميع جديد أسفل العمود. لحصاد الورم المعلق ، قم بشفط الوسط من لوحة الزراعة المشتركة لخلايا سرطان الدم ، واستخدم نفس الوسيط لشطف اللوحة برفق مرة واحدة. بعد ذلك ، انقل المجموعة الفرعية لخلايا اللوكيميا المعلقة العائمة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

لحصاد مجموعة الورم Phase Bright الفرعية ، أضف 10 ملليلتر من الوسط الطازج مرة أخرى إلى لوحة الزراعة المشتركة. وشطف ما يقرب من خمس مرات بقوة كافية لإزالة خلايا ابيضاض الدم الملتصقة دون إزاحة الطبقة الأحادية للخلية الملتصقة. بعد ذلك ، قم بنقل السكان الفرعيين Phase Bright إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 ملليلترا.

لحصاد المجموعة الفرعية للورم الخافت المرحلة ، قم بإزالة الوسط المتبقي بشطف PBS سعة مليلتر واحد. وافصل الخلايا بثلاثة ملليلتر من التربسين عند 37 درجة مئوية. بعد خمس دقائق، اضغط برفق على جوانب اللوحة لإخراج الخلايا الملتصقة، متبوعا بإضافة مليلتر واحد من FBS لإيقاف التفاعل الأنزيمي.

بعد ذلك ، اشطف المصل ثلاث إلى خمس مرات لتفكيك أي مجاميع كبيرة للخلايا. ونقل الفئة الفرعية غير المنقاة من Phase Dim إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا. عندما يتم جمع جميع المجموعات السكانية الفرعية ، قم بتدوير الخلايا.

وأعد تعليق كل من الكريات في مليلتر واحد من الوسط الدافئ مسبقا. مع إغلاق محبس تماما ، لكل مجموعة سكانية فرعية ، استخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لإضافة حجم مليلتر واحد بالكامل من الخلايا ، بالتنقيط ، إلى الجزء العلوي من أحد أعمدة G10 المعدة ، مع التأكد من بقاء الخلايا فوق أو داخل حبيبات G10. اسمح للخلايا بالتحتضن على حبيبات G10 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم أضف ملليلترا إلى ثلاثة ملليلتر من الوسط الطازج المسخن مسبقا إلى العمود. وافتح محبس حتى يخرج الوسيط ببطء من الأعمدة ، بالتنقيط. استمر في إضافة وسيط مسخن مسبقا إلى الأعمدة بزيادات واحدة إلى ملليلترتين.

عندما يتم جمع ما مجموعه 15 إلى 20 مل من خلايا سرطان الدم ، أغلق محبس وقم بتغطية أنبوب التجميع. ثم, قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت المناسب لتحليل المصب. بعد التربسين لطبقة الخلية الملتصقة ، لوحظت مجموعتين متميزتين من الخلايا عن طريق تحليل التشتت الأمامي مقابل الجانبي.

بعد فصل G10 ، يتم استرداد مجموعة نقية من خلايا ابيضاض الدم اللمفاوي الحاد. من المثير للاهتمام بشكل خاص أن جميع خلايا المرحلة الخافتة التي تم استردادها من الخلايا اللحمية لنخاع العظم ، أو المزارع المشتركة لبانيات العظم ، تظهر القليل من الموت أو معدومة بعد تعرضها للعلاج الكيميائي السام للخلايا. أثناء محاولة هذه الإجراءات، من المهم أن تتذكر تنفيذ هذه الخطوات بشكل صحيح قدر الإمكان لتقليل أي تغيرات نمطية قد تحدث في خلايا سرطان الكريات.

توفر هذه التقنية طريقة للباحثين في مجال أبحاث سرطان الدم لنمذجة سرطان الدم المقاوم للعلاج الكيميائي في نموذج في المختبر يشبه إلى حد كبير البيئة المكروية لنخاع العظم.