تطوير وبناء الجرذ نموذج ألفا synuclein لمرض باركنسون عن طريق حقن المجسم من النواقل الفيروسية المؤتلف المرتبطة الغدة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير نموذج حيواني لمرض باركنسون يعتمد على ناقل فيروسي عن طريق الحقن المجسم في الجهاز العصبي المركزي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتطوير نماذج حيوانية قياسية تتيح إجراء اختبارات الأدوية في المرحلة قبل السريرية، ويمكن أن تكون مفيدة في دراسة الآلية الجزيئية لمرض باركنسون بالإضافة إلى العديد من الاضطرابات التنكسية العصبية الأخرى. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية استخدامها لاستهداف مناطق محددة من الدماغ.

يمكن تحقيق تعبير مرتفع لـ trenching في الدماغ، كما يمكن استخدامه لإنشاء نماذج حيوانية في سلالات وأنواع حيوانية محددة. وقد تم تطوير أنظمة ناقلات نهائية مختلفة، ويعتمد اختيار نظام الناقل على حجم الـ trenching المراد التعبير عنه، ومدة التعبير الجيني، والأنسجة المستهدفة، وقضايا السلامة البيولوجية.

ستقوم أنيليس أيرتغيرت، وهي فنية من مختبرنا، بشرح الإجراء. ابدأ بتخدير أنثى جرذ من سلالة Wistar تبلغ من العمر ثمانية أسابيع بشكل صحيح وفقاً للبروتوكولات المعتمدة. تأكد من الوصول إلى مستوى التخدير الجراحي عن طريق الضغط على كل مخلب، وملاحظة غياب منعكس السحب.

بعد ذلك، استخدم جهاز زرع MicroTransponder لوضع MicroTransponder على ظهر الجرذ. تأكد من وضع MicroTransponder بشكل صحيح ومن إمكانية الحصول على قراءة. الآن، قم بقص الشعر عن فروة رأس الجرذ، ووضع مخدر موضعي على فروة الرأس والأذنين.

انقل الجرذ إلى غطاء التدفق الصفائحي، وأكمل بقية الإجراء باستخدام تقنية التعقيم. ضع الجرذ في الإطار التجسيمي، وذلك عن طريق تثبيت قضبان الأذن، متبوعة بقضيب الفم والأنف. غطِّ جسم الجرذ ببطانية ورقية لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم.

ضع مرطباً للعين لمنع جفافها. بعد ذلك، قم بتطهير فروة الرأس وفقاً للإجراءات المعتمدة. يُستخدم هنا محلول اليود بتركيز 1% في 70% isopropyl.

بعد إجراء شق صغير في الخط المتوسط لفروة الرأس، اكشط الأغشية الموجودة على الجمجمة برفق، واشطفها بمحلول ملحي. بعد ترك الجمجمة لتجف، تأكد من إمكانية رؤية bregma و lambda بوضوح. الآن، املأ حقنة حقن مجهري سعة 10 µL، وبقياس 30 gauge وطول 20 mm بـ AAV المؤتلف، ثم ضعها في مضخة الحقن المجهري الآلية المتصلة بالجهاز التجسيمي (stereotaxic instrument).

من أجل نقل الجينات بشكل محدد إلى العصبونات الدوبامينية في المادة السوداء، تُعد ناقلات AV المؤشبة الخيار الأول نظراً لعناوينها العالية وكفاءتها في نقل الجينات إلى العصبونات الدوبامينية. اختبر تدفق السائل عن طريق إطلاق قطرة من AAV. تخلص من أي كمية مُسربة من AAV باستخدام منظف تنظيف متعدد الاستخدامات.

تحقق بصرياً من تثبيت الرأس بشكل مستقيم في إطار الرأس. ثم تحقق من استواء الجمجمة، وذلك بتحريك طرف الإبرة أولاً إلى منطقة bregma وقياس الارتفاع عند هذه النقطة، عن طريق خفض طرف الإبرة في الاتجاه الظهري-البطني حتى يلامس الجمجمة. كرر الإجراء عند منطقة lambda.

بعد إعادة الإبرة إلى نقطة البريغما (bregma)، حرك الإبرة في الاتجاهين الأمامي الخلفي والإنسي الوحشي وصولاً إلى الإحداثيات التجسيمية المحددة للحقن المجهري. دون هذه الإحداثيات. عند موقع الحقن، قم بقياس ارتفاع الجمجمة كما فعلت سابقاً، وتأكد من أن الفرق لا يتجاوز 0.3mm عن ارتفاع نقطة البريغما (bregma).

ثم قم بحفر ثقب بقطر 2 mm بعناية في الجمجمة. وبمجرد حفر الثقب، قم بقياس ارتفاع الأم الجافية لتحديد المرجع الذي سيتم بناءً عليه تطبيق الإحداثي الظهري البطني. ثم اخترق الأم الجافية باستخدام إبرة قياس 26 gauge.

قم بامتصاص أي دم باستخدام المنديل المعقم، ولا تتابع العمل إلا بعد توقف جميع النزيف. والآن، قم بخفض إبرة محقنة الحقن المجهري المشحونة مسبقاً ببطء داخل الدماغ وصولاً إلى الإحداثي الظهري-البطني. ثم توقف لمدة دقيقة واحدة.

ثم احقن 3 µL من AAV بمعدل 0.25 µL في الدقيقة. بعد الحقن، اترك الإبرة في مكانها لمدة خمس دقائق أخرى لمنع التدفق العكسي على طول مسار الإبرة قبل إزالتها ببطء. قم بخياطة فروة الرأس باستخدام خيوط بوليستر مضفرة مرمزة 3.0 وعقم الجلد باستخدام اليود بتركيز 1% و70% isopropyl.

قم بفك قضيب الأنف والفم، ثم قضيبَي الأذنين، لإخراج الحيوان برفق من الجهاز التجسيمي (stereotaxic instrument). في هذه المرحلة، قم بإعطاء مسكن للألم، وإذا لزم الأمر، عامل عكس التخدير. ثم ضع الجرذ في قفص نظيف فوق لوح تسخين مضبوط على 38 درجة Celsius، وراقبه بدقة حتى يستيقظ.

بعد الجراحة، يمكن دراسة حركية التنكس العصبي في الحيوان كاملاً باستخدام الاختبارات السلوكية والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET)، وبعد التضحية بالحيوان، باستخدام تقنيات الكيمياء النسيجية المناعية. تم إجراء اختبار الأسطوانة لتقييم الاستخدام التلقائي للطرف الأمامي في نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن المجهري لـ AAV المؤتلف الذي يعبر عن طفرة A53T في بروتين alpha synuclein داخل المادة السوداء. وبدءاً من ثلاثة أسابيع بعد الحقن، لوحظ ضعف حركي ملحوظ في الجرذان التي تلقت الجرعة المتوسطة.

بعد مرور أربعة أسابيع على الحقن، لوحظ انخفاض بنسبة 50% في الاستخدام التلقائي للقائمة الأمامية المقابلة. بينما لم تظهر الحيوانات التي حُقنت بـ eGFP الضابطة أي عدم تماثل في استخدام القائمة الأمامية. أما الجرذان التي تلقت جرعة أعلى من recombinant AAV 2/7A53T alpha synuclein، فقد أظهرت ضعفاً أكثر وضوحاً في استخدام القائمة الأمامية بعد 29 يوماً من الحقن.

لإثبات أن الخلل الحركي الملحوظ كان معتمداً على الدوبامين، تم إعطاء جرعة واحدة من L-dopa. وعند تكرار اختبار الأسطوانة بعد 45 دقيقة من العلاج بـ L-dopa، لوحظ تعافٍ كامل في استخدام الطرف الأمامي لدى الحيوانات التي حُقنت بـ AAV 2/7A53T alpha synuclein المؤتلف. ولمتابعة حركية التنكس العصبي الدوباميني في المسار الأسود المخططي بشكل غير جراحي بمرور الوقت في كل حيوان على حدة، تم قياس ارتباط ناقل الدوبامين باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني للحيوانات الصغيرة مع استخدام F-18FECT كرابط مشع.

انخفض ارتباط DAT بشكل ملحوظ في النواة المذنبة في الجانب نفسه من الفئران التي حُقنت بـ AAV 2/7A53 alpha synuclein المؤتلف بمرور الوقت. وبعد 32 يومًا، لُوحظ انخفاض في ارتباط DAT بنسبة تصل إلى 85%. وكعنصر تحكم إيجابي، أدى حقن السم العصبي 6 OHDA في SN إلى فقدان 90% من ارتباط DAT في غضون سبعة أيام.

تم إجراء صبغ مناعي لقطاعات دماغية من جرذان حُقنت مجهرياً بـ AAV 2/7A53T recombinant alpha synuclein على مدى فترة زمنية للكشف عن tyrosine hydroxylase، وهو مؤشر للخلايا العصبية الدوبامينية. يوضح هذا الشكل الفقدان التدريجي للخلايا العصبية الدوبامينية على مدار 29 يوماً بعد الحقن المجهري. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 45 دقيقة.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم استخدام ناقلات نهائية مطابقة وعالية الجودة. وبالإضافة إلى هذا الإجراء، يمكن إجراء تقنيات أخرى، مثل التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) غير الباضع، وتحليل السلوك، والتحليل الكيميائي النسيجي المناعي، وذلك لتحديد مستوى التنكس العصبي والاعتلال العصبي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إجراء حقن ناقل فيروسي في المادة السوداء من أجل تطوير نماذج حيوانية تعتمد على النواقل الفيروسية لمرض باركنسون.

لا تنسَ أن العمل باستخدام النواقل الفيروسية قد يكون خطيراً، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل العمل تحت تدفق رقائقي (laminar flow) والتخلص السليم من النفايات وتعقيمها عند اتباع هذا الإجراء.