تطوير وبناء الجرذ نموذج ألفا synuclein لمرض باركنسون عن طريق حقن المجسم من النواقل الفيروسية المؤتلف المرتبطة الغدة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير نموذج حيواني قائم على نواقل الفيروس لمرض باركنسون عن طريق الحقن التجسيمي في الجهاز العصبي المركزي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتطوير نماذج حيوانية طبيعية تسمح باختبار الأدوية قبل السريرية ويمكن أن تكون مفيدة في دراسة الآلية الجزيئية لمرض باركنسون بالإضافة إلى العديد من الاضطرابات التنكسية العصبية الأخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لاستهداف مناطق دماغية محددة.

يمكن تحقيق تعبير دماغي عالي الخنادق ويمكن استخدامه لإنشاء نماذج حيوانية في سلالات وأنواع حيوانية معينة. تم تطوير أنظمة المتجهات النهائية المختلفة. يعتمد اختيار نظام المتجهات على حجم الخنادق التي تريد التعبير عنها ، ومدة التعبير الجيني ، والأصوات التي تريد استهدافها ، ومشكلات السلامة الحيوية.

توضيح الإجراء Annelies Aertgeerts ، فني من مختبرنا. ابدأ بتخدير أنثى فأر ويستار البالغة من العمر ثمانية أسابيع بشكل صحيح وفقا للبروتوكولات المعتمدة. تأكد من تحقيق مستوى جراحي للتخدير عن طريق الضغط على كل مخلب ، وملاحظة عدم وجود منعكس الانسحاب.

بعد ذلك ، استخدم جهاز زرع MicroTransponder لوضع جهاز الإرسال والاستقبال الدقيق على ظهر الفئران. تحقق من وضع جهاز الإرسال والاستقبال الصغير بشكل صحيح وأنه يمكن الحصول على قراءة. الآن قص الشعر على فروة رأس الفئران ، وتطبيق مخدر موضعي على فروة الرأس والأذنين.

انقل الفئران إلى غطاء التدفق الصفحي ، وقم بتنفيذ بقية الإجراء باستخدام تقنية معقمة. ضع الجرذ في الإطار التجسيمي ، عن طريق تأمين قضبان الأذن ، متبوعا بشريط الفم والأنف. قم بتغطية جسم الجرذ ببطانية ورقية لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم.

ضع مادة تشحيم العين لمنع جفاف العينين. بعد ذلك ، قم بتطهير فروة الرأس وفقا للإجراءات المعتمدة. يتم استخدام واحد في المائة من اليود في 70٪ من الأيزوبروبيل هنا.

بعد إجراء شق صغير في خط منتصف فروة الرأس ، اكشط الأغشية الموجودة على الجمجمة برفق ، واشطفها بالمحلول الملحي. بعد ترك الجمجمة تجف ، تأكد من رؤية بريجما ولاجدا بوضوح. الآن ، املأ حقنة حقن مجهرية سعة 10 ميكرو لتر و 30 مقياسا 20 ميلومتر ب AAV المؤتلف وضعها على مضخة الحقن الدقيقة الآلية المتصلة بأداة التجسيم.

لمعاملة محددة من الخلايا العصبية الدوبامين من المادة السوداء, ناقلات AV المؤتلف هي الخيار الأول بسبب عياراتها العالية وكفاءتها لتحويل الخلايا العصبية الدوبامينية. اختبر التدفق عن طريق إطلاق قطرة من AAV. تخلص من أي AAV تم إطلاقه في منظف تنظيف متعدد التكافؤ.

تحقق بصريا من تثبيت الرأس بشكل مستقيم في إطار الرأس. ثم تأكد من أن الجمجمة مسطحة ، عن طريق تحريك طرف الإبرة أولا إلى بريجما وقياس الارتفاع في هذه المرحلة ، عن طريق خفض طرف الإبرة في الاتجاه الظهري البطني حتى تلامس الجمجمة. كرر الإجراء في لامدا.

بعد إعادة الإبرة إلى بريجما ، حرك الإبرة في الاتجاه الأمامي الخلفي والجانبي الإنسي إلى الإحداثيات التجسيمية للحقن المجهري. اكتب الإحداثيات. في موقع الحقن ، قم بقياس ارتفاع الجمجمة كما كان من قبل ، وتأكد من أنها لا تختلف عن أكثر من 0.3 مم من ارتفاع البرجما.

ثم حفر بعناية ثقب بحجم ملليمترين في الجمجمة. بمجرد حفر الحفرة ، قم بقياس ارتفاع الجافية لتحديد المرجع الذي يتم من خلاله تطبيق الإحداثيات الظهرية البطنية. اخترق الجافية باستخدام إبرة قياس 26.

امتصاص أي دم بالأنسجة المعقمة ، واستمر فقط بعد توقف كل النزيف. الآن قم بخفض إبرة حقنة الحقن المجهري المحملة مسبقا ببطء في الدماغ إلى الإحداثيات الظهرية البطنية. وتوقف لمدة دقيقة واحدة.

ثم حقن ثلاثة لترات صغيرة من AAV بمعدل 0.25 ميكرو لتر في الدقيقة. بعد الحقن ، اترك الإبرة في مكانها لمدة خمس دقائق أخرى لمنع التدفق العكسي على طول مسار الإبرة قبل إزالتها ببطء. قم بغرز فروة الرأس باستخدام البوليستر المضفر 3.0 وقم بتطهير البشرة باستخدام واحد بالمائة من اليود و 70٪ من الأيزوبروبيل.

لفك شريط الأنف والفم ، ثم قضيبتي الأذن ، لإزالة برفق من الأداة التجسيمية. في هذا الوقت ، قم بإدارة التسكين ، وإذا لزم الأمر ، عامل عكس التخدير. ثم ضع الجرذ في قفص نظيف على لوح تسخين مضبوطة على 38 درجة مئوية ، وراقبه عن كثب حتى يستيقظ.

بعد الجراحة ، يمكن دراسة حركية التنكس العصبي في بأكمله باستخدام الاختبارات السلوكية والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني وبعد التضحية باستخدام تقنيات الكيمياء المناعية. تم إجراء اختبار الأسطوانة لتقييم الاستخدام التلقائي للطرف الأمامي في نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن المجهري ل AAV المؤتلف الذي يعبر عن A53T Mutation alpha synuclein في المادة السوداء. من ثلاثة أسابيع بعد الحقن ، لوحظ ضعف حركي كبير في الفئران التي تلقت متوسط الجرعة.

في أربعة أسابيع بعد الحقن, لوحظ انخفاض 50٪ في استخدام المخلب الأمامي المقابل تلقائيا. في حين أن التحكم eGFP الذي تم حقنه لم يظهر أي عدم تناسق في استخدام المخلب الأمامي. أظهرت الفئران التي تلقت جرعة أعلى من AAV 2 / 7A53T ألفا سينوكلين المؤتلف ضعفا أكثر وضوحا في استخدام مخلب الأمام في 29 يوما بعد الحقن.

لإثبات أن الضعف الحركي الملحوظ كان يعتمد على الدوبامين ، تم إعطاء جرعة واحدة من L-doba. عندما تم تكرار اختبار الأسطوانة بعد 45 دقيقة من العلاج ب L-dopa ، لوحظ تعافي كامل لاستخدام المخلب الأمامي في المؤتلفة AAV 2 / 7A53T alpha synuclein المحقونة. لمتابعة حركية التنكس العصبي الدوبامين الأضراري الأنيجروسترياتي بشكل غير جراحي بمرور الوقت ، في الفردية ، تم قياس الارتباط المنقول بالدوبامين باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني للحيوانات الصغيرة مع F-18FECT كشريط إشعاعي.

انخفض ارتباط DAT بشكل ملحوظ في البوديمان المذنبي المماثل للفئران المؤتلفة AAV 2 / 7A53T ألفا سينوكلين المحقون بمرور الوقت. بعد 32 يوما ، لوحظ انخفاض في ارتباط DAT بنسبة تصل إلى 85٪. كعنصر تحكم إيجابي ، أدى حقن السم العصبي 6 OHDA في SN إلى فقدان ارتباط DAT بنسبة 90٪ في غضون سبعة أيام.

تلطيخ أقسام الدماغ من الفئران التي تم حقنها ب AAV 2 / 7A53T المؤتلف ألفا سينوكلين بمرور الوقت لهيدروكسيلاز التيروزين ، وهي علامة على الخلايا العصبية الدوبامينية. يوضح هذا الرقم الفقدان التدريجي للخلايا العصبية الدوبامين على مدى 29 فترة أيام بعد الحقن المجهري. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في 45 دقيقة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام تطابقات متجهة نهائية عالية الجودة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تقنيات أخرى ، مثل التصوير المبثوني غير الجراحي ، وتحليل السلوك ، والتحليل الكيميائي المناعي لتحديد مستوى التنكس العصبي وعلم الأمراض العصبية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إجراء حقن ناقل فيروسي في المادة السوداء من أجل تطوير نماذج حيوانية قائمة على النواقل الفيروسية لمرض باركنسون.

لا تنس أن العمل مع النواقل الفيروسية يمكن أن يكون خطيرا ، وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل تحت التدفق الرقائقي وإزالة التلوث المناسب للنفايات باتباع هذا الإجراء.