الفروق بين الجنسين في ماوس الحصين النجمية بعد في المختبر نقص التروية

الهدف العام من هذه التقنية هو إعداد مزارع الخلايا النجمية الحصين المخصبة الخاصة بالجنس من الفئران حديثي الولادة كأداة لدراسة الأدوار الخاصة بالجنس للخلايا النجمية بعد الحرمان من الأكسجين والجلوكوز وإعادة الأكسجة من أجل تقليد نقص تروية نقص التأكسج في الجسم الحي في بيئة زراعة الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الميكانيكية والانتقالية الرئيسية المتعلقة بالدور الخاص بالجنس للخلايا النجمية في الحصين بعد نقص تروية نقص الأكسجين في تطوير أدمغة الذكور والإناث. قم بتشريح الدماغ من رأس جرو فأر حديث الولادة باستخدام مقص صغير لإنشاء شق خلفي إلى أمامي في خط الوسط عبر الجلد لكشف الجمجمة.

قطع خط الوسط الجمجمة بعناية من الرقبة إلى الأنف. استخدم ملقطا معقما ذو طرف مسطح لتقشير الجمجمة. قم بإزالة جذع الدماغ بمساعدة ملقط منحني وضع الدماغ المتبقي في طبق تشريح.

باستخدام ملقط منحني ، اقلب الدماغ بحيث يكون السطح البطني متجها لأعلى ثم افصل نصفي الكرة الأرضية بشفرة جراحية حادة ومعقمة. باستخدام ملقط منحني مسطح ، قم بتقشير نصفي الكرة المخية وإزالة الدماغ الأوسط المنتفخ والأنسجة المهادية بعناية للكشف عن الحصين ، وهو هيكل صغير على شكل فرس البحر في الفص الصدغي الإنسي. قم بإزالة كل من فصوص الحصين وتنظيف السحايا والخلايا الليفية بعناية من سطح الفصوص عن طريق السحب بالملقط الناعم.

انقل فصوص الحصين من فأر واحد إلى طبق ثان مليء بحوالي 5 ملليلتر من HBSS وضعه على الثلج. افرم الفصوص حوالي 4 مرات باستخدام شفرة جراحية معقمة حادة. استخدم ماصة معقمة سعة 1 مليلتر لنقل HBSS والأنسجة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مليلتر ثم جهاز طرد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 5 دقائق.

بعد الطرد المركزي ، استنشق المادة الطافية. أضف 3 ملليلتر من 0.25 في المائة من التربسين ، واخلطها واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع رج لطيف. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 مرة G لمدة 5 دقائق.

بعد الدوران ، استخدم ماصة زجاجية معقمة لشفط المادة الطافية بعناية ثم أضف 10 مل من وسط طلاء الخلايا النجمية الدافئ مسبقا. قم بترتيتر 20 إلى 30 مرة باستخدام ماصة زجاجية مصقولة بالنار. بعد الطرد المركزي لمدة 5 دقائق أخرى عند 300 مرة G ، قم بسحب المادة الطافية وإضافة 2 مل من وسائط طلاء الخلايا النجمية.

قم بتمرير تعليق الخلية من خلال مرشح شبكي 70 ميكرون إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. أضف تعليق الخلية بالكامل إلى قارورة ثقافة T-25 معقمة مطلية تحتوي على 3 ملليلتر من وسائط طلاء الخلايا النجمية. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.

في اليوم التالي ، لاحظ تطور التقاء الخلايا النجمية تحت المجهر الضوئي ، واستنشق الوسائط واستبدلها ب 2 مل من وسائط طلاء الخلايا النجمية الطازجة. حوالي 11 يوما في المختبر ، قم بحصاد الخلايا النجمية المتقاربة عن طريق شفط الوسائط ثم إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين. قم بتدوير القارورة برفق عدة مرات ثم قم بشفط التربسين باستخدام ماصة زجاجية معقمة.

أضف 2 مل أخرى من 0.25٪ التربسين واترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 4-5 دقائق. بعد إزالة التربسين ، ضع القارورة على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO2 لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، أضف 5 ملليلتر من وسط طلاء الخلايا النجمية وافصل الطبقة النجمية عن طريق طرق القارورة من 3 إلى 4 مرات.

قم بتقطيع تعليق الخلية برفق عبر الجزء السفلي من القارورة لتحقيق الانفصال الكامل ثم اجمع الخلايا النجمية في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي للأنبوب عند 300 مرة G لمدة 5 دقائق. قم بشفط المادة الطافية ثم أضف 1 مليلتر من وسط طلاء الخلايا النجمية الطازجة.

أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى مقياس كثافة الدم واستخدم مجهر تباين الطور المقلوب بهدف 10x لحساب الخلايا في المنطقة المركزية الكبيرة الشبكية. تمييع الخلايا إلى ما يقرب من 1 مرة من 10 إلى 5 خلايا لكل 2 ملليلتر من وسط طلاء الخلايا النجمية. ماصة 2 مل من تعليق الخلية على غطاء زجاجي مطلي ب poly-d lysine في بئر طبق ثقافة 24 بئرا.

احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. لبدء الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، قم بشفط الوسط من الغطاء الذي يحتوي على الخلايا النجمية الملتصقة واشطفه مرة واحدة ب 1 مليلتر من محلول OGD متساوي التوتر. أضف 0.2 مل من محلول OGD إلى البئر وضعه في حاضنة نقص الأكسجين.

امزج برفق باستخدام شاكر مداري مضبوطة على 50 دورة في الدقيقة لأول 30 دقيقة من نقص الأكسجة. لإعادة الأكسجين ، استبدل محلول OGD ب 2 مل من وسط طلاء الخلايا النجمية واحتضان 5٪ من ثاني أكسيد الكربون والهواء الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات. تظهر صورة التألق المناعي هذه نقاء ثقافة الخلايا النجمية الأولية لحصين الفأر.

تم تلطيخ ثقافة الخلايا النجمية بالمناعة لإظهار علامة التغصنات العصبية ، MAP2 ، باللون الأحمر ، وعلامة الخلايا الدبقية الصغيرة ، IBA1 ، باللون الأخضر. النوى ملطخة ب DAPI الذي يظهر باللون الأزرق. يشير السهم إلى تلوث الخلايا الدبقية الصغيرة.

تظهر هذه الصورة المناعية التمثيلية للخلايا النجمية الحصينية المستنبتة في ظل الظروف الطبيعية ، النشاط المناعي GFAP باللون الأحمر وعلامة HIF1-alpha باللون الأخضر. مرة أخرى ، يتم تلطيخ النوى ب DAPI الذي يظهر باللون الأزرق. يشير السهم إلى تعبير HIF1-alpha منخفض.

بعد ساعتين من الحرمان من الأكسجين والجلوكوز و 5 ساعات من إعادة الأكسجين ، زاد تعبير HIF1-alpha في الخلايا النجمية الحصين المزروعة كما هو موضح في رأس السهم الذي يشير إلى ارتفاع التعبير النووي HIF1-alpha. تم تنظيم تعبير GFAP وتعبير S100b في مزارع الخلايا النجمية في الحصين من ذكور الفئران بعد الحرمان من الأكسجين والجلوكوز وإعادة التغذية. كما لوحظ تنظيم S100b و GFAP في الخلايا النجمية التي تم الحصول عليها من إناث الفئران.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، والنشاف الغربي ، و siRNA ، والتلطيخ الكيميائي المناعي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التغييرات الخاصة بالجنس في بعض التعبيرات الجينية والبروتينية التي تلي نقص التروية في المختبر. بعد تطويرها ، يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف آثار وعواقب السكتة الدماغية في الحصين الذين يدرسون الخلايا النجمية في الثقافة.