الفروق بين الجنسين في ماوس الحصين النجمية بعد

الهدف العام من هذه التقنية هو تحضير مستنبتات غنية من الخلايا النجمية في الحصين والمحددة جنسياً من صغار الفئران حديثة الولادة، وذلك كأداة لدراسة الأدوار المحددة جنسياً للخلايا النجمية بعد الحرمان من الأكسجين والجلوكوز وإعادة الأكسجة، لمحاكاة نقص التروية الناجم عن نقص الأكسجين في الجسم الحي ضمن بيئة المستنبتات الخلوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة ميكانيكية وترجمية رئيسية تتعلق بالدور المحدد جنسياً للخلايا النجمية في الحصين بعد نقص التروية الناجم عن نقص الأكسجين في أدمغة الذكور والإناث النامية. يتم تشريح الدماغ من رأس جرو فأر حديث الولادة باستخدام مقصات صغيرة لإجراء شق خط وسط من الخلف إلى الأمام عبر الجلد لكشف الجمجمة.

اقطع خط منتصف الجمجمة بعناية من الرقبة وصولاً إلى الأنف. استخدم ملاقط معقمة ذات طرف مسطح لإزالة القحف. استأصل جذع الدماغ بمساعدة ملاقط منحنية وضع ما تبقى من الدماغ في طبق التشريح.

باستخدام ملقط منحني، اقلب الدماغ بحيث يكون السطح البطني متجهًا للأعلى، ثم افصل نصفي الكرة المخية باستخدام شفرة جراحية معقمة وحادة. وباستخدام ملقط منحني ومسطح، قم بإزاحة نصفي الكرة المخية للخلف وأزل بعناية أنسجة الدماغ المتوسط والمهاد البارزة للكشف عن الحصين، وهو هيكل صغير يشبه فرس البحر يقع في الفص الصدغي الإنسي. استأصل كلا فصي الحصين ونظف بعناية السحايا والأرومات الليفية من سطح الفصوص عن طريق سحبها باستخدام ملقط دقيق.

انقل كلا فصي الحصين من فأر واحد إلى طبق ثانٍ يحتوي على 5 ملليلتر تقريباً من HBSS وضعهما على الثلج. قم بتقطيع الفصين فرمًا حوالي 4 مرات باستخدام شفرة جراحية معقمة وحادة. استخدم ماصة معقمة سعة 1 ملليلتر لنقل HBSS والأنسجة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلتر، ثم قم بالطرد المركزي عند 300 ×g لمدة 5 دقائق.

بعد الطرد المركزي، قم بسحب السائل الطافي. أضف 3 milliliters من trypsin بتركيز 0.25 percent، ثم اخلط المزيج واحضن النسيج عند 37 degrees Celsius لمدة 20 minutes مع الرج اللطيف. بعد انتهاء فترة الحضن، قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 300 times G لمدة 5 minutes.

بعد عملية الطرد المركزي، استخدم ماصة زجاجية معقمة لسحب السائل الطافي بعناية، ثم أضف 10 milliliters من وسط زراعة الخلايا النجمية المسخن مسبقاً. قم بعملية التجانس (Trituration) من 20 إلى 30 مرة باستخدام ماصة زجاجية مصقولة بالنار. وبعد عملية طرد مركزي أخرى لمدة 5 دقائق عند 300 times G، اسحب السائل الطافي وأضف 2 milliliters من وسط زراعة الخلايا النجمية.

مرر معلق الخلايا عبر مرشح شبكي بمسامية 70 micron في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter. أضف معلق الخلايا بالكامل إلى دورق زراعة T-25 معقم ومطلي يحتوي على 3 milliliters من وسط زراعة الخلايا النجمية. حضن الدورق عند درجة حرارة 37 degrees Celsius في حضانة تحتوي على 5% carbon dioxide.

في اليوم التالي، راقب تطور تلاحم الخلايا النجمية باستخدام المجهر الضوئي، ثم اسحب الوسط واستبدله بـ 2 milliliters من وسط زراعة الخلايا النجمية الطازج. وبعد حوالي 11 يومًا في المختبر، قم بحصد الخلايا النجمية المتلاحمة عن طريق سحب الوسط ثم إضافة 2 milliliters من 0.25%trypsin. قم بتدوير القارورة بلطف بضع مرات، ثم اسحب الـ trypsin باستخدام ماصة زجاجية معقمة.

أضف 2 milliliters أخرى من 0.25%trypsin واترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 4-5 دقائق. بعد إزالة trypsin، ضع القارورة عند 37 degrees Celsius في حاضنة 5%CO2 لمدة 10 دقائق. بعد الحضن، أضف 5 milliliters من وسط زراعة الخلايا النجمية وقم بفصل الطبقة النجمية عن طريق نقر القارورة من 3 إلى 4 مرات.

قم بسحق معلق الخلايا بلطف عبر قاع القارورة لتحقيق الانفصال التام، ثم اجمع الخلايا النجمية في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 300 ×g لمدة 5 minutes. اسحب السائل الطافي ثم أضف 1 milliliter من وسط استنبات الخلايا النجمية الطازج.

أضف 10 µL من معلق الخلايا إلى مقياس كرات الدم (hemocytometer)، واستخدم مجهراً مقلوباً بتباين طوري مع عدسة شيئية 10x لعد الخلايا في المنطقة الشبكية المركزية الكبيرة. خفف الخلايا لتصل إلى ما يقرب من 1 × 10⁵ خلية لكل 2 mL من وسط زراعة الخلايا النجمية. انقل 2 mL من معلق الخلايا بواسطة الماصة إلى شريحة غطاء زجاجية مطلية بـ poly-d lysine في بئر من أطباق زراعة ذات 24 بئراً.

قم بالتحضين عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون. لبدء عملية الحرمان من الأكسجين والجلوكوز، اسحب الوسط من الغطاء الزجاجي الذي يحتوي على الخلايا النجمية الملتصقة واشطفه مرة واحدة باستخدام 1 milliliter من محلول OGD متساوي التوتر. أضف 0.2 milliliters من محلول OGD إلى البئر وضعه في حاضنة نقص الأكسجة.

اخلط بلطف باستخدام هزاز مداري مضبوط على 50 rpm خلال أول 30 دقيقة من نقص الأكسجة. ولإعادة الأكسجة، استبدل محلول OGD بـ 2 milliliters من وسط زراعة الخلايا النجمية ثم حضنها في 5% من ثاني أكسيد الكربون والهواء الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات. تُظهر هذه الصورة المناعية الفلورية نقاء مستنبت الخلايا النجمية الأولية من حصين الفأر.

تم إجراء صبغ مناعي لمزرعة الخلايا النجمية لإظهار مؤشر الزوائد الشجيرية العصبونية، MAP2، باللون الأحمر، ومؤشر الخلايا الدبقية الصغيرة، IBA1، باللون الأخضر. صُبغت النوى باستخدام DAPI الذي يظهر باللون الأزرق. يشير السهم إلى تلوث بالخلايا الدبقية الصغيرة.

تُظهر هذه الصورة الممثلة للتألق المناعي للخلايا النجمية في الحصين المستنبتة تحت ظروف الأكسجة الطبيعية، التفاعل المناعي لـ GFAP باللون الأحمر ووسم HIF1-alpha باللون الأخضر. مرة أخرى، صُبغت النوى بـ DAPI الذي يظهر باللون الأزرق. ويشير السهم إلى تعبير منخفض لـ HIF1-alpha.

بعد ساعتين من الحرمان من الأكسجين والجلوكوز و5 ساعات من إعادة الأكسجة، زاد تعبير HIF1-alpha في الخلايا النجمية المزروعة من الحصين، كما يشير رأس السهم الذي يوضح ارتفاع تعبير HIF1-alpha النووي. وقد ارتفع تعبير GFAP وتعبير S100b في مزارع الخلايا النجمية من الحصين المأخوذة من ذكور الفئران بعد الحرمان من الأكسجين والجلوكوز وإعادة الأكسجة. كما لوحظ أيضًا ارتفاع تعبير S100b و GFAP في الخلايا النجمية المستمدة من إناث الفئران.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR)، واللطخة الغربية (western blotting)، والحمض الريبي النووي التدخلي الصغير (siRNA)، والتصبيغات الكيميائية النسيجية المناعية، وذلك للإجابة على أسئلة إضافية مثل التغيرات المحددة للجنس في تعبيرات جينات وبروتينات معينة بعد حدوث نقص تروية في المختبر. وبعد تطوير هذه التقنية، يمكنها أن تمهد الطريق للباحثين في مجال علوم الأعصاب لاستكشاف تأثيرات وعواقب السكتة الدماغية في الحصين من خلال دراسة الخلايا النجمية في المزارع الخلوية.