Name: تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية والتبليط في أقسام الأنسجة السميكة العائمة بحرية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: تعلم تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية والتبليط في أقسام الأنسجة السميكة العائمة بحرية باستخدام دماغ الفأر. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة دور البروتينات المحددة في تطور الخلايا النجمية وتفاعلاتها.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم إجراء الفحص المجهري في مركز UNC Neuroscience Microscopy Core (RRID:SCR_019060) ، مدعوما جزئيا بتمويل من منحة دعم مركز العلوم العصبية NIH-NINDS P30 NS045892 ومنحة دعم مركز أبحاث الإعاقات الفكرية والتنموية التابع للمعاهد الوطنية للصحة النباتية - NICHD U54 HD079124. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com. تتم إعادة طباعة الصور والبيانات الواردة في الشكل 4 من منشور سابق9 بإذن من الناشر.

<ol><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li>
<li>Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytogenesis%3A+where%2C+when%2C+and+how%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Astrocytogenesis: where, when, and how.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biology%22%5BJournal%5D)">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+individual+astrocytes+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy.</a> Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92(2020).</li>
<li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemico-genetic+discovery+of+astrocytic+control+of+inhibition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo.</a> Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).</li>
<li>Baldwin, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepaCAM+controls+astrocyte+self-organization+and+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling.</a> Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).</li>
<li>Amberg, N., Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+dissection+of+candidate+genes+in+mice+using+mosaic+analysis+with+double+markers%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100939(2021).</li>
<li>Dumas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+of+multiaddressable+genome-integrating+color+%28MAGIC%29+markers+to+individualize+cortical+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110(2020).</li>
<li>Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-glia+from+pallial+progenitors+produce+the+largest+clonal+clusters+of+the+brain%3A+time+frame+of+clonal+generation+in+cortex+and+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communication. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+states+of+astrocytes+during+sleep+and+wakefulness%3A+Is+norepinephrine+the+master+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Sleep+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator.</a> Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

يصف هذا البروتوكول طريقة راسخة لتحليل حجم أراضي الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية في قشرة الفأر ، مع تفصيل جميع الخطوات الرئيسية التي تبدأ بالتروية وتنتهي بتحليل الصور. يتطلب هذا البروتوكول أدمغة من الفئران التي تعبر عن البروتينات الفلورية في مجموعة متفرقة أو فسيفساء من الخلايا النجمية. خارج هذا المطلب، يمكن استخدام الفئران من أي عمر لهذا البروتوكول، مع تعديلات طفيفة فقط على إعدادات التروية وحجم وسائط التجميد المضافة إلى قالب التضمين. في حين تم نشر طرق أخرى لتحليل تعقيد وحجم تفرع الخلايا النجمية في أقسام أنسجة المخ<...

الخلايا النجمية هي خلايا متفرعة بشكل متقن تؤدي العديد من الوظائف المهمة في الدماغ1. في قشرة الفأر ، تؤدي الخلايا الجذعية الدبقية الشعاعية إلى ظهور الخلايا النجمية خلال المراحل الجنينية المتأخرة والمبكرة بعد الولادة2. خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة ، تنمو الخلايا النجمية في الحجم والتعقيد ، وتطور الآلاف من الفروع الدقيقة التي تتفاعل مباشرة مع نقاط الاشتباك العصبي1. في الوقت نفسه ، تتفاعل الخلايا النجمية مع الخلايا النجمية المجاورة لإنشاء مناطق منفصلة وغير متداخلة لتجانب الدماغ3 ، مع الحفاظ على الاتصال عبر قنوات تقاطع الفجوة4. تتعطل مورفولوجيا الخلايا النجمية وتنظيمها في العديد من الحالات المرضية بعد الإهانة أو الإصابة5 ، مما يشير إلى أهمية هذه العمليات لوظائف الدماغ السليمة. يمكن أن يوفر تحليل الخصائص المورفولوجية للخلايا النجمية أثناء التطور الطبيعي والشيخوخة والمرض رؤى قيمة في بيولوجيا الخلايا النجمية وعلم وظائف الأعضاء. علاوة على ذلك ، يعد تحليل مورفولوجيا الخلايا النجمية بعد التلاعب الجيني أداة قيمة لتمييز الآليات الخلوية والجزيئية التي تحكم إنشاء وصيانة التعقيد المورفولوجي للخلايا النجمية.
تحليل مورفولوجيا الخلايا النجمية في دماغ الفأر معقد بسبب كل من تعقيد تفرع الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية. تلطيخ الأجسام المضادة باستخدام البروتين الحمضي الليفي الدبقي الخيطي الوسيط (GFAP) كعلامة خاصة بالخلايا النجمية يلتقط فقط الفروع الرئيسية ، ويقلل إلى حد كبير من التعقيد المورفولوجي للخلايا النجمية1. تقوم علامات أخرى خاصة بالخلايا مثل ناقل الغلوتامات 1 (GLT-1 ؛ slc1a2) أو جلوتامين سينثيتاز أو S100β بعمل أفضل في وضع العلامات على فروع الخلايا النجمية6 ، ولكنها تقدم مشكلة جديدة. مناطق الخلايا النجمية غير متداخلة إلى حد كبير ، ولكن توجد درجة صغيرة من التداخل عند الحواف الطرفية. بسبب تعقيد التفرع ، عندما يتم تصنيف الخلايا النجمية المجاورة بنفس اللون ، من المستحيل التمييز بين المكان الذي تنتهي فيه إحدى الخلايا النجمية وتبدأ الأخرى. إن وضع العلامات المتناثرة أو الفسيفسائية للخلايا النجمية مع البروتينات الفلورية الذاتية المنشأ يحل كلتا المشكلتين: تملأ علامة الفلورسنت الخلية لالتقاط جميع الفروع وتسمح بتصوير الخلايا النجمية الفردية التي يمكن تمييزها عن جيرانها. تم استخدام العديد من الاستراتيجيات المختلفة لتحقيق وضع العلامات الفلورية المتناثرة للخلايا النجمية ، مع أو بدون التلاعب الجيني ، بما في ذلك الحقن الفيروسي ، أو كهربية البلازميد ، أو خطوط الفئران المعدلة وراثيا. يتم وصف تفاصيل تنفيذ هذه الاستراتيجيات في الدراسات والبروتوكولات المنشورة سابقا1،7،8،9،10،11،12،13.
توضح هذه المقالة طريقة لقياس حجم مساحة الخلايا النجمية من أدمغة الفئران باستخدام وسم الفلورسنت في مجموعة متفرقة من الخلايا النجمية (الشكل 1). نظرا لأن متوسط قطر الخلايا النجمية في قشرة الفأر يبلغ حوالي 60 ميكرومتر ، يتم استخدام أقسام بسماكة 100 ميكرومتر لتحسين الكفاءة في التقاط الخلايا النجمية الفردية بالكامل. التلطيخ المناعي غير مطلوب ولكن يوصى به لتعزيز إشارة الفلورسنت الذاتية المنشأ للتصوير والتحليل البؤري. قد يتيح التلطيخ المناعي أيضا كشفا أفضل لفروع الخلايا النجمية الدقيقة ويقلل من التبييض الضوئي للبروتينات الداخلية أثناء الحصول على الصورة. لتحسين تغلغل الأجسام المضادة في الأقسام السميكة ، وللحفاظ على حجم الأنسجة من التقسيم من خلال التصوير ، يتم استخدام أقسام الأنسجة العائمة بحرية. يتم إجراء تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية باستخدام برنامج تحليل الصور المتاح تجاريا. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة لتحليل بلاط الخلايا النجمية في أقسام الأنسجة مع وضع علامات الفسيفساء ، حيث تعبر الخلايا النجمية المجاورة عن تسميات فلورية مختلفة. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح في العديد من الدراسات الحديثة1،8،9 لتوصيف نمو الخلايا النجمية أثناء نمو الدماغ الطبيعي ، وكذلك تأثير التلاعب الجيني على تطور الخلايا النجمية.

<table><tbody><tr><td># 5 ملقط</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>1 مل تيرابايت حقنة</td><td>بيكتون ديكنسون (BD)</td> <td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS (محلول ملحي مخفض ثلاثي)</td><td></td><td></td> <td>30 جم تريس ، 80 جم كلوريد الصوديوم ، 2 جم كلوريد كلوريد ، حمض الهيدروكلوريك إلى درجة الحموضة 7.4 ، ديسيرام < تحت >2< / فرعي > إلى 1 لتر ؛ يحفظ في درجة حرارة الغرفة (RT)</td></tr> <tr><td>لوحة 12 بئر</td><td>جينيسي Scientific</td><td>25-106 ميجابكسل</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS</td><td></td><td></td><td>100 مل 10x TBS + 900 مل dH2O; يحفظ في RT</td></tr><tr><td>1x TBS + Heparin</td><td></td><td></td><td>28.2 مجم هيبارين + 250 مل 1x TBS ؛ يحفظ في درجة حرارة 4 درجات ؛ C</td></tr><tr><td>24 بئر لوحة</td><td>جينيسي Scientific</td><td>25-107MP</td><td></td></tr><tr><td>30٪ سكروز في TBS</td><td></td><td></td><td>15 جرام سكروز ، 1x TBS إلى 50 مل ؛ تخزين في 4 درجات ؛ C</td></tr><tr><td>4٪ PFA (بارافورمالدهايد) في TBS</td><td></td><td></td><td>40 جم PFA ، 4-6 كريات هيدروكسيد الصوديوم ، 100 مل 10x TBS ، dH2O إلى 1 لتر ؛ تخزين عند 4 درجات ؛ C</td></tr><tr><td>أفيرتين</td><td></td><td></td><td>0.3125 جم ثلاثي بروموإيثانول ، 0.625 مل ميثيل بوتانول ، dH 2O إلى 25 مل ؛ تخزين في 4 درجات ؛ C; تخلص من أسبوعين بعد إجراء</td></tr><tr><td>حجب وعازلة</td><td></td><td></td> للأجسام <td>المضادة 10٪ مصل الماعز في TBST ؛ تخزين في 4 درجات ؛ C</td></tr><tr><td>CD1 الفئران</td><td>تشارلز ريفر</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>مجموعة قارورة للأدمغة</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>03-337-20</td><td></td></tr><tr><td>برنامج الاستحواذ متحد البؤر</td><td>أوليمبوس</td><td>FV31S-SW</td><td></td></tr><tr><td>المجهر متحد البؤر</td><td>أوليمبوس</td><td>FV3000RS</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>فيشر Scientific</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>CryoStar NX50</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat blade</td><td>Thermo Scientific</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>تضمين القالب</td><td>Polysciences</td><td>18646A-1</td><td></td></tr><tr><td>التجميد المتوسط</td><td></td><td></td><td>2: 1 30٪ السكروز: OCT ؛ تخزين في RT</td></tr><tr><td>GFP الأجسام المضادة</td><td>Aves Labs</td><td>GFP1010</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>ثيرمو ساینتيفيك</td><td>158920010</td><td></td></tr><tr><td>مضاد للماعز 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>الماعز المضاد للأرانب 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>مصل الماعز</td><td>جيبكو</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>الهيبارين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>حمض الهيدروكلوريك</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N / A</td><td>الإصدار 9.8.0</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>علبة غداء معدنية</td><td>AQUARIUS</td><td>N / A</td><td>من أمازون ، "صندوق المرح الكبير DIY"</td></tr> <tr><td>ميثيل بوتانول</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>152463</td><td></td></tr><tr><td>مقص تشريح دقيق</td><td>Roboz</td><td>RS-5921</td><td></td></tr><tr><td>تصاعد الوسط</td><td></td><td></td><td>20 ملي مولار تريس درجة الحموضة 8.0 ، 90٪ جلسرين ، 0.5٪ N-بروبيل غالات ؛ تخزين في 4 درجات ؛ C; جيد لمدة تصل إلى شهرين</td></tr><tr><td>طلاء الأظافر</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>N-propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02370-100G</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>زيت</td><td>أوليمبوس</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td>خاص بالمجهر /</td></tr><tr><td>الهدف مقص التشغيل 6 "</td><td>Roboz</td><td>RS-6820</td><td></td></tr><tr><td>شاكر المنصة المدارية</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>88861043</td><td>الحد الأدنى للسرعة المطلوبة: 25 دورة في الدقيقة</td></tr><tr><td>فرشاة</td><td>الرسم Bogrinuo</td><td>N / A</td><td>من أمازون ، "فرش الطلاء التفصيلية - فرش مصغرة "</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ماصة باستور (5.75 بوصة) VWR</td><td></td> <td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>ماصة باستور (9 بوصات) VWR</td><td></td> <td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>شفرة حلاقة</td><td>فيشر Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RFP الجسم المضاد</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>وسط التقسيم</td><td></td><td></td><td>1: 1 الجلسرين: 1x TBS ؛ تخزين في RT</td></tr><tr><td>Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>كرولويد الصوديوم</td><td>فيشر Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد الصوديوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>السكروز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TBST (TBS + Triton X-100)</td><td></td><td></td> <td>0.2٪ Triton في 1x TBS ؛ تخزينها في RT</td></tr><tr><td>Transfer Pipet</td><td>VWR</td><td>414004-002</td><td></td></tr><tr><td>Tri-bromoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td><td>Thermo Scientific</td><td>424570025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 ( جودة عالية)</td> <td>فيشر Scientific</td><td>50-489-120</td><td></td></tr><tr><td>XTSpotsConvexHull</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>توفر XTension المخصصة كمواد تكميلية</td></tr></tbody></table>

تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية والتبليط في أقسام الأنسجة السميكة العائمة بحرية

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

تمتلك الخلايا النجمية درجة مذهلة من التعقيد المورفولوجي الذي يمكنها من التفاعل مع كل نوع من الخلايا والبنية تقريبا داخل الدماغ. من خلال هذه التفاعلات ، تنظم الخلايا النجمية بنشاط العديد من وظائف الدماغ الحرجة ، بما في ذلك تكوين المشبك العصبي ، والنقل العصبي ، والتوازن الأيوني. في دماغ القوارض ، تنمو الخلايا النجمية في الحجم والتعقيد خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الولادة وتنشئ مناطق متميزة وغير متداخلة لتجانب الدماغ. يوفر هذا البروتوكول طريقة راسخة لتحليل حجم منطقة الخلايا النجمية وتبليط الخلايا النجمية باستخدام أقسام الأنسجة العائمة الحرة من دماغ الفأر. أولا ، يصف هذا البروتوكول خطوات جمع الأنسجة ، والتقسيم بالتبريد ، والتلطيخ المناعي لأقسام الأنسجة العائمة الحرة. ثانيا، يصف هذا البروتوكول اكتساب الصور وتحليل حجم أراضي الخلايا النجمية وحجم تداخل الأراضي، باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة تجاريا. وأخيرا، تناقش هذه المخطوطة المزايا والاعتبارات الهامة والمزالق الشائعة والقيود المفروضة على هذه الأساليب. يتطلب هذا البروتوكول أنسجة المخ مع وضع علامات فلورية متفرقة أو فسيفسائية على الخلايا النجمية ، وهو مصمم للاستخدام مع معدات المختبر الشائعة ، والمجهر البؤري ، وبرامج تحليل الصور المتاحة تجاريا.

ويقدم الشكل 1 مخططا تخطيطيا للخطوات الرئيسية وسير العمل لهذا البروتوكول. يوضح الشكل 2 لقطات شاشة للخطوات الرئيسية باستخدام برنامج تحليل الصور لإنشاء سطح ، وتوليد بقع قريبة من السطح ، وإنشاء بدن محدب. يوضح الشكل 3 تطبيق هذه التقنية لتحديد تداخل/تبليط أراضي الخلايا النجمية. في الشكل 4، توضح النتائج التمثيلية من مخطوطة منشورة سابقارقم 9 تطبيق هذا البروتوكول. في ...

يصف هذا البروتوكول طرق تقسيم وتلطيخ وتصوير أقسام الأنسجة العائمة الحرة في دماغ الفأر ، متبوعا بوصف مفصل لتحليل حجم منطقة الخلايا النجمية وتداخل أراضي الخلايا النجمية أو تبليطها.

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

إن فهم كيفية تطور الخلايا النجمية وتأسيسها لمورفولوجيتها المعقدة أمر ضروري لفهم كيفية تطور الدماغ ووظائفه. يصف هذا البروتوكول كيفية تحليل الجوانب الرئيسية لمورفولوجيا الخلايا النجمية في أنسجة المخ. يستخدم هذا البروتوكول رمزا مخصصا لقياس حجم منطقة الخلايا النجمية في أقسام الأنسجة السميكة.يمكن أيضا تطبيق هذه الاستراتيجية لقياس مقدار تداخل الأراضي بين الخلايا النجمية المجاورة. من خلال الجمع بين هذا البروتوكول والتلاعب الجيني بالخلايا النجمية ، يمكن للباحثين التحقيق مباشرة في دور بروتينات ومسارات محددة في تطوير الخلايا النجمية والتفاعل بين الخلايا النجمية والخلايا النجمية للبدء ، قم بإعداد حل جديد من TBST عن طريق إضافة 1 ملليلتر من 10٪ Triton X إلى أنبوب 50 ملليلتر وملء الأنبوب إلى 50 ملليلتر ب TBS. قم بإعداد 2 ملليلتر من حلول الحجب والأجسام المضادة لكل دماغ عن طريق الجمع بين مصل الماعز و TBST في أنبوب 15 ملليلتر.بعد ذلك ، قم بتسمية لوحة من 24 بئرا لوضع عينات مختلفة في صفوف مختلفة في حلول مختلفة في أعمدة مختلفة ، ثم أضف ملليلتر واحد من TBST إلى الأعمدة الثلاثة الأولى التي تحمل علامة wash 1 و wash 2 و wash 3 ، وأضف 1 ملليلتر من محلول الحجب إلى العمود الرابع. قم بإعداد معول زجاجي عن طريق إذابة نهاية ماصة باستور مقاس 5.75 بوصة في خطاف صغير باستخدام موقد بنسن ، ثم انقل مقاطع الأنسجة من اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى عمود الغسيل 1 من لوحة 24 بئرا باستخدام المعول ، ثم اغسل الأقسام لمدة 10 دقائق لكل منها في الغسيل 1 ، 2 ، و 3 آبار باستخدام الالتقاط الزجاجي لنقل الأقسام من بئر إلى آخر ، تليها احتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في محلول الحظر. تحضير q ملليلتر من محلول الأجسام المضادة الأولية عن طريق إضافة الجسم المضاد إلى محلول الأجسام المضادة ، ثم دوامة لفترة وجيزة والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في أكبر من أو يساوي 4،000 مرة غرام عند 4 درجات مئوية.بعد ذلك ، احتضن الأقسام في الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 إلى 3 ليال عند 4 درجات مئوية أثناء الاهتزاز. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، قم بشفط اليوم 1 TBST من آبار الغسيل ، ثم أضف 1 ملليلتر من TBST الجديد إلى كل غسل جيدا وانقل الأقسام إلى الغسيل الأول جيدا. بعد ذلك ، احتضان الأقسام في الأجسام المضادة الثانوية لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، قم بشفط اليوم-2 TBST من آبار الغسيل ، ثم أضف 1 ملليلتر من TBST الجديد إلى كل غسل جيدا وانقل الأقسام إلى الغسيل الأول جيدا. أثناء الغسيل النهائي ، أخرج وسائط التركيب من 4 درجات مئوية واتركها تدفئ إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإعداد خليط من 2 إلى 1 من TBS والماء منزوع الأيونات وأضفه إلى طبق بتري. بعد ذلك ، قم بإعداد شريحة مجهرية بإضافة 800 ميكرولتر من خليط 2 إلى 1 من TBS والماء منزوع الأيونات إلى السطح.انقل الأقسام من الغسيل 3 جيدا إلى طبق بتري ، ثم باستخدام فرشاة طلاء دقيقة ، انقل الأقسام واحدة تلو الأخرى من طبق بتري إلى السائل الموجود على الشريحة. بعد ذلك ، رتب الأقسام بعناية بحيث تكون مسطحة على الشريحة باستخدام فرشاة الطلاء. بعناية ، قم بإزالة السائل الزائد من الشريحة باستخدام ماصة P-1000 ، متبوعة بشفط الفراغ.بمجرد إزالة كل السائل الزائد من الشريحة ، استخدم ماصة نقل لإضافة 1 قطرة من وسائط التركيب على الفور إلى كل قسم ووضع انزلاق غطاء برفق فوق الشريحة. اسمح لوسائط التركيب بالانتشار لبضع دقائق ثم قم بإزالة أي وسائط تركيب زائدة تخرج من تحت الغطاء عن طريق الشفط الفراغي. بعد ذلك ، قم بإغلاق جميع الحواف الأربعة للغطاء باستخدام طلاء أظافر شفاف.اترك الشرائح تجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم قم بتخزينها بشكل مسطح عند 4 درجات مئوية. باستخدام هدف 10x ، حدد موقع الخلايا الفردية للتصوير ولاحظ منطقة الدماغ المحددة أو المنطقة الفرعية ذات الصلة بالتجربة ، ثم باستخدام مقبض التركيز البؤري ، حدد ما إذا كانت الخلايا النجمية بأكملها موجودة داخل القسم. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى هدف زيت تكبير أعلى وجعل الخلية في بؤرة التركيز.أثناء النظر من خلال قطعة العين ، استخدم مقبض التركيز البؤري للانتقال من أعلى الخلية إلى أسفلها ، ثم افحص الخلية بصريا للتأكد من احتواء الخلية بأكملها داخل القسم. باستخدام برنامج الاستحواذ المرتبط بالمجاهر البؤرية ، اضبط معلمات الاكتساب للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مناسبة ومستوى من التفاصيل ، ثم استخدم تكبير/تصغير 2x لهدف 40x ولا يوجد تكبير إذا كنت تستخدم هدفا 60x أو 63x. اضبط الحدود العلوية والسفلية للمكدس Z بحجم خطوة يبلغ 0.5 ميكرومتر لضمان التقاط الخلايا النجمية بأكملها باستخدام الصور الأولى والأخيرة دون أي وسم فلورسنت للخلية.قبل البدء في التحليل ، قم بتثبيت ملف امتداد الهيكل المحدب ، XtspotsConvexHull ، عن طريق لصق الملف في المجلد الفرعي rtmatlab من مجلد XT. باستخدام محول ملفات Imaris ، قم بتحويل الصور إلى تنسيق IMS. بعد ذلك ، افتح ملف صورة في برنامج تحليل الصور وحدد زر 3D View لعرض الصورة في وضع 3D ، مما يضمن أن الخلية تفي بمعايير التضمين.لإنشاء سطح، انقر على أيقونة إضافة أسطح جديدة باللون الأزرق، ثم قم بإنشاء منطقة ذات أهمية حول الخلية عن طريق إدخال الأبعاد في المربعات تحت حجم أداة إنشاء السطح أو سحب حواف المربع الأصفر. بعد ذلك ، اضبط الكثافة المطلقة للعتبة عن طريق سحب الشريط الأصفر أو إدخال القيم في المربع بحيث يملأ السطح الرمادي أكبر قدر ممكن من إشارة الخلية دون تجاوز حدود الخلية. بعد ذلك ، انقر فوق السهم الأخضر لإنهاء توليد السطح.افحص السطح الذي تم إنشاؤه حديثا بعناية واحذف أي قطع سطحية ليست جزءا من الخلية عن طريق تحديدها ، ثم انقر فوق أداة تحرير القلم الرصاص متبوعة بخيار حذف. لتوحيد القطع السطحية المتبقية ، انقر فوق أيقونة مرشح القمع لتحديد الكل ، ثم انقر فوق أيقونة تحرير القلم الرصاص وحدد خيار توحيد. انقر فوق أيقونة إضافة بقع جديدة برتقالية وحدد قناة المصدر الصحيحة من القائمة المنسدلة ، ثم أدخل قيمة قطر XY المقدرة ب 0.400 ميكرومتر في المربع.بعد ذلك ، انقر فوق السهم الأخضر لإنهاء إنشاء البقع ، ثم أعد تحديد البقع. انقر فوق أيقونة التصفية وحدد أقصر مسافة إلى الأسطح الأسطح X حيث الأسطح X هي السطح الذي يتم تحليله من القائمة المنسدلة، مما يضمن أن يكون كل من زري طاقة العتبة الدنيا والعتبة العليا أخضرين. بعد ذلك ، أدخل مسافة لا تقل عن 1.0 ميكرومتر في مربع العتبة السفلية ومسافة قصوى تبلغ 0.1 ميكرومتر في مربع العتبة العليا ، ثم انقر فوق الزر قسم مكرر إلى بقع جديدة ، مما يضمن تحديد البقع التي تم إنشاؤها حديثا في اللوحة العلوية اليسرى من نافذة البرنامج.بعد ذلك ، انقر فوق رمز Gear Tools ، ثم انقر فوق المكون الإضافي Convex Hull مرة واحدة فقط وانتظر حتى تظهر نافذة MATLAB ثم تختفي مما يؤدي إلى هيكل صلب في عرض 3D. في اللوحة العلوية اليمنى ، تأكد من تحديد الهيكل المحدب للبقع X ، أقصر مسافة حيث تحديد البقع X هو تحديد البقع التي تم إنشاؤها حديثا ثم انقر فوق الهيكل لتحديده. بعد ذلك ، انقر فوق رمز إحصائيات الرسم البياني.في علامة التبويب تحديد، تأكد من تحديد قيم محددة من القائمة المنسدلة العلوية ثم اختر مستوى الصوت من القائمة المنسدلة السفلية، ثم قم بتسجيل حجم الهيكل وحفظ الملف، وانتقل إلى الصورة التالية. تم قياس حجم منطقة الخلايا النجمية في الخلايا النجمية التي تعبر عن بروتين فلورسنت أحمر يستهدف الغشاء. ضربة قاضية من جزيء التصاق الخلايا الغنية بالخلايا النجمية ، hepaCAM ، يقلل بشكل كبير من حجم منطقة الخلايا النجمية.تم استخدام تحليل الفسيفساء مع علامات مزدوجة لتوليد الفئران حيث تعبر الخلايا النجمية من النوع البري عن بروتين الفلورسنت الأحمر والخلايا النجمية الضربة القاضية الكبدية الكبدية عن بروتين الفلورسنت الأخضر. تم حساب النسبة المئوية لتداخل الأراضي بين أزواج الخلايا النجمية المجاورة للبروتين الفلوري الأحمر والأخضر. أظهرت الفئران التي لديها تعديل وراثي للكبد والخلايا النجمية الخضراء زيادة كبيرة في نسبة تداخل الأراضي مع جيرانها من النوع البري الأحمر مقارنة بأزواج الخلايا النجمية من النوع البري فقط.توضح هذه النتيجة أن hepaCAM مطلوب لحجم أراضي الخلايا النجمية الطبيعي ، وتبليط الخلايا النجمية. من الأهمية بمكان التأكد من أن الخلية تفي بمعايير التضمين. سيكون للخلية غير المكتملة حجم منطقة أصغر وقد تؤثر على نتائجك واستنتاجاتك الإجمالية.

analysis-astrocyte-territory-volume-tiling-thick-free-floating-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يوضح هذا الفيديو إجراء تلطيخ قسم أنسجة دماغ الفئران الثابت مع الخلايا النجمية المصنفة بالفلورسنت باستخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية والتقاط صور الخلايا النجمية الملطخة من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.

تلطيخ مناعي للخلايا النجمية المصنفة بالفلورسنت في قسم أنسجة دماغ الفئران

المصدر: موي، س. ل.، }et.al.  تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الرحلان الأيوني الأصفر لوسيفر. J. Vis. Exp. (2019).   يوضح هذا الفيديو استخدام الرحلان الأيوني للصبغة الفلورية لدراسة مورفولوجيا الخلايا النجمية في شرائح الدماغ الثابتة. إنه يوضح بالتفصيل ثقب سوما الخلايا النجمية باستخدام قطب كهربائي لتوصيل صبغة أنيونية محبة للماء إلى السيتوبلازم تحت تيار منخفض الجهد ، مما يمكن الصبغة من نشر وتسمية سوما والفروع. ثم يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتصور الخلايا النجمية المسماة ، مما يوفر...

تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الرحلان الأيوني للصبغة الفلورية في شريحة دماغ الفأر الثابتة

المصدر: Bagheri, M., et. al. بروتوكول التحليل المورفومتري متحد البؤر ثلاثي الأبعاد للخلايا النجمية. J. Vis. Exp. (2015).يوضح هذا الفيديو تصوير الخلايا النجمية المصنفة بالفلورسنت في قسم دماغ الفأر باستخدام مجهر متحد البؤر. يتم وضع قسم الدماغ تحت العدسة الموضوعية المناسبة ، ويتم اختيار الفلوروفورات والمرشحات المناسبة. بعد تحسين التعرض تلقائيا ، يتم تحديد معلمات المسح الضوئي لضمان صور ثنائية الأبعاد عالية الدقة. يتم تكوين معلمات Z-stack ، ويتم الحصول على صور ثلاثية الأبعاد.

التصوير ثلاثي الأبعاد للخلايا النجمية ذات العلامات المناعية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر

الخلايا النجمية في الجهاز العصبي المركزي تغير خصائصها الوظيفية والهيكلية استجابة للمنبهات الضارة. يقدم هذا التقرير بروتوكولا لتقييم مورفولوجيا الخلايا النجمية ثلاثية الأبعاد في الحالات المريضة أو بعد التدخلات العلاجية.

بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

نقدم هنا بروتوكولا لتقييم المنظمة لشبكات أستروسيتيك. الأسلوب وصف يقلل من التحيز لتوفير تدابير وصفية لهذه الشبكات مثل عدد الخلايا، وحجم ومجال والموقف داخل نواة. ويتم تقييم تباين مع تحليل اتجاهي.

تحليل في الحجم والشكل واتجاهية شبكات من أستروسيتيس إلى جانب

تم تصميم خط الأنابيب الموصوف لتقسيم مجموعات البيانات المجهرية الكترون أكبر من غيغابايت ، لاستخراج مورفولوجيس الخلية الكاملة. وبمجرد أعاده بناء الخلايا في 3D ، يمكن استخدام البرمجيات المخصصة المصممة حول الاحتياجات الفردية لاجراء تحليل نوعي وكمي مباشره في 3D ، وأيضا باستخدام الواقع الافتراضي للتغلب علي انسداد العرض.

طريقه لأعاده البناء 3D وتحليل الواقع الافتراضي للخلايا العصبية والخلايا الددالي

الخلايا النجمية هي خلايا معقدة من الناحية الشكلية، وتتمثل في عملياتها المتعددة وأراضيها الكثيفة. لتحليل مورفولوجيا تفصيلا، ونحن نقدم بروتوكول موثوق بها لأداء الأيونتوبهوريس الأصفر داخل الخلايا في الأنسجة الثابتة طفيفة.

تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس الأصفر لوسيفر

هنا نقوم بوصف طريقة التصوير الحي في المختبر لتصور النقل داخل الخلايا من العضيات والاتجار ببروتينات غشاء البلازما في الخلايا النجمية المورين. ويقدم هذا البروتوكول أيضا منهجية لتحليل الصور لتحديد مسارات نقل البضائع وحركيتها.

تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية

أستروقراط بلاط قشرة الدماغ بشكل موحد، مما يجعل تحليل مورفولوجيا معقدة صعبة على المستوى الخلوي. يستخدم البروتوكول المقدم هنا وضع علامات متعددة الألوان استنادًا إلى الإلكتروبورات الرحمية لخَرَد الخلايا الفلكية القشرية وتحليل حجمها ومورفولوجياها باستخدام خط أنابيب لتحليل الصور سهل الاستخدام.

في Electroporation الرحمية من متعدد الجينوم التكامل اللون (السحر) علامات لفردية استروقراط الماوس القشرية

يسمح الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وتطهير الدماغ باستخدام طريقة CLARITY بالتحقيق في عدد كبير من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في وقت واحد.

التحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية في الأدمغة الواضحة

تعلم تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية والتبليط في أقسام الأنسجة السميكة العائمة بحرية باستخدام دماغ الفأر. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة دور البروتينات المحددة في تطور الخلايا النجمية وتفاعلاتها.

تحليل حجم أراضي الخلايا النجمية والتبليط في أقسام الأنسجة السميكة العائمة بحرية

استكشف المزيد من الفيديوهات