يطل في الدماغ Polysomes مع مجهر القوة الذرية

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير خط أنابيب مفصل لتنقية وترسب عديد الريبوسومات الدماغية بدقة الميكا والحصول على آلاف الصور بدقة النانو دون الحاجة إلى معالجة لاحقة ثقيلة أو تحليلات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الترجمة والتحكم الانتقالي ، مثل فهم تأثير تنظيم الريبوسوم داخل البوليزومات أثناء إعادة توصيل التعبير الجيني. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في عدم الحاجة إلى تثبيت العينة أو وضع العلامات عليها ، ويمكن إجراء القياسات في ظروف فسيولوجية قريبة لتحديد الريبوسومات وحوامل الحمض النووي الريبي العارية بسهولة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتنظيم بوليريبوسوم الثدييات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية الدقيقة الأخرى ، مثل الخميرة والبكتيريا والحشرات ، بالإضافة إلى الحالة التي تنطوي على ضوابط انتقالية للتعبير الجيني. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث أن التعامل مع العينة المتعددة الأطراف لامتصاص الميكا وخطوات الغسيل أمر صعب للغاية ويتطلب مهارات وخبرات في المناولة. سيظهر الإجراء باولا برنابو ولورينزو لونيلي.

للبدء ، قم بجمع وتجميد أنسجة المخ كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. ثم اسحب المناديل المجمدة من الفريزر وأحضرها إلى المقعد. ضع أنسجة المخ المجمدة والنيتروجين السائل في ملاط مبرد مسبقا وسحقها باستخدام مدقة حتى تتشكل مسحوق.

انقل حوالي 25 ملليغراما من مسحوق الدماغ إلى أنبوب طرد مركزي بارد وأضف على الفور 0.8 مل من محلول التحلل. قم بعرض الخليط لأعلى ولأسفل 25 مرة بسرعة لتعطيل الخلايا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 12 ، 000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية لتكوير الحطام الخلوي.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد واحتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق لنوى الحبيبات والميتوكوندريا. بعد ذلك ، قم بإزالة ملليلتر واحد بعناية من أعلى تدرج السكروز المعد مسبقا.

تراكب السكروز قطرة قطرة مع المطاف من المحلل الخلوي. مع تحميل العينة الآن أعلى التدرج ، قم بخفض الأنبوب بعناية وأنبوب الموازنة في دلاء دوار دلو متأرجح. الطرد المركزي التدرج لمدة 100 دقيقة.

بعد الطرد المركزي الفائق ، اترك الأنابيب في دلائها لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، للسماح للتدرج بالاستقرار. بعد ذلك ، قم بإزالة أنبوب العينة بعناية وقم بتثبيته على جهاز التجميع لنظام تجزئة تدرج الكثافة. اجمع كسور مليلتر واحدة أثناء مراقبة امتصاص الأحماض النووية عند 260 نانومتر باستخدام كاشف الضوء المرئي للأشعة فوق البنفسجية وضعها على الجليد.

بعد ذلك ، قم بإعداد 30-40 ميكرولتر من الكسور ذات الأهمية ، واحتفظ بها على الجليد. إذا لم يتم استخدام العينات على الفور ، فقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية واتخذ خطوات للحد من عدد دورات التجميد والذوبان. لتحضير عينات لتصوير AFM ، قم أولا بتغطية ورقة الميكا المغسولة ب 200 ميكرولتر من كبريتات النيكل الثانية المليمولية واحتضان الورقة لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة المحلول ، وجفف السطح بالهواء المضغوط ، وضع طبق بتري على الثلج. بعد ذلك ، أضف الحصة بأكملها برفق من جزء الفائدة قطرة قطرة على الميكا. باستخدام طرف 100 أو 200 ميكرولتر ، انشر العينة على كامل سطح الميكا ، واحتضن العينة على الجليد لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك ، قم بتغطية ورقة الميكا قطرة قطرة ب 200 ميكرولتر من AFM البارد واحتضان العينة على الجليد لمدة ساعة واحدة. يعد الحفاظ على العينة عند 40 درجة واستخدام المخزن المؤقت البارد الذي تم تحضيره في ماء خال من RNase أمرا مهما للحفاظ على تنظيم البولي ريبوسوم. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت بعناية واغسل الميكا ثلاث إلى أربع مرات باستخدام 200 ميكرولتر من AFM البارد لإزالة أي سكروز زائد.

ثم اغسل الميكا ثلاث مرات بمحلول الغسيل البارد وصفي الماء الزائد من الميكا باستخدام الورق. تعد الإزالة الكاملة للسكروز من عينات المواد الماصة أمرا بالغ الأهمية الآن بعد أن قطعت كل من الريبوسوم والحمض النووي الريبي العاري في كثيرات الجسيم. اترك العينة لتجف تحت الغطاء الكيميائي مع فتح الجزء العلوي من طبق بتري جزئيا.

بعد ساعتين ، أغلق طبق بتري. يمكن الآن تخزين العينة في درجة حرارة الغرفة. قم بتوصيل العينة المحضرة بحامل عينة AFM باستخدام شريط على الوجهين.

بعد ذلك ، أدخل حامل العينة في مرحلة AFM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد المعايرة ، اقترب من العينة حتى يشبك طرف الكابولي السطح. حدد منطقة مسح ضوئي من اثنين في ميكرونين ، بدقة لا تقل عن 512 × 512 بكسل ، واختر وضع طرح الخلفية الحية ، وحدد مقياس Z من 20-25 نانومتر.

ثم ابدأ في الحصول على الصور. افحص الصورة ، وابحث عن وجود أجسام مستديرة تتميز بارتفاع يتراوح بين 10 و 15 نانومتر عند الحصول على صور في الهواء. بعد ذلك ، اضبط نقطة الضبط ومعلمات التغذية الراجعة حتى يتم تصور الكائنات الحادة.

يجب أن تظهر الخلفية مسطحة نسبيا في العينات الجيدة التي تحتوي على كائنات بارتفاع حوالي 2 إلى 4 نانومتر. بمجرد أن تبدو الصورة جيدة ، احصل على عدة عمليات مسح ضوئي اثنين في ميكرون في مناطق عينة مختلفة. بعد ترسب السكروز على الميكا ، يوفر AFM أوصافا دقيقة لحجم البوليسومات المفردة التي تظهر على شكل مجموعات من الريبوسومات المعبأة بإحكام.

يكشف إلقاء نظرة فاحصة على إحدى قمم الريبوسومات باستخدام تحليل المقطع العرضي أن ارتفاع قمم الريبوسومات يبلغ حوالي 14 نانومتر. يتطابق هذا مع ما لوحظ سابقا للريبوسومات البشرية والبوليزومات بعد التجفيف بالهواء. في الصورة الموجودة على اليمين ، تم استخدام ماكرو لتحديد موقع الريبوسوم وتمييز كل ريبوسوم بدائرة حمراء.

باستخدام هذه المعلومات ، يمكن تحليل توزيع التردد لعدد الريبوسومات لكل متعدد الجدول. تم تجهيز هذا التوزيع التجريبي بمنحنى غاوسي متمركز عند 5.8 ريبوسومات لكل بوليجسوم ، مع انحراف معياري قدره 1.3. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية من سحق الدماغ إلى الحصول على صور البولي ريبوسوم في أقل من ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء العينة على الجليد واستخدام المخازن الباردة لترسب العينة على الميكا. باتباع هذا الإجراء ، وباستخدام المكون الإضافي ImageJ الخاص بأحد المطورين لإتاحته في ورقتك ، يمكنك حساب عدد الريبوسوم بدقة لكل بوليجسوم. بعد كل تطور ، ستمهد هذه التقنية الطريق لفهم حركية تكوين كثرة الجبات وتحديد التغييرات في تنظيم تعدد الجسيمات وظروفها الخلوية أو الأنسجية المختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على آلاف الصور متعددة الأشكال لتحليل منظمتهم ودراستهم بشكل منهجي.