يطل في الدماغ Polysomes مع مجهر القوة الذرية
مارس 16, 2016
بينما تم تمييز بنية الريبوسوم على نطاق واسع ، لا يزال تنظيم تعدد الأشكال غير مدروس. للتغلب على هذا النقص في المعرفة ، نقدم هنا بروتوكول تحضير مفصل للتصوير الدقيق لعدسات الثدييات عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) في الهواء والسائل.
الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير خط أنابيب مفصل لتنقية وترسب عديد الريبوسومات الدماغية بدقة الميكا والحصول على آلاف الصور بدقة النانو دون الحاجة إلى معالجة لاحقة ثقيلة أو تحليلات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الترجمة والتحكم الانتقالي ، مثل فهم تأثير تنظيم الريبوسوم داخل البوليزومات أثناء إعادة توصيل التعبير الجيني. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في عدم الحاجة إلى تثبيت العينة أو وضع العلامات عليها ، ويمكن إجراء القياسات في ظروف فسيولوجية قريبة لتحديد الريبوسومات وحوامل الحمض النووي الريبي العارية بسهولة.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتنظيم بوليريبوسوم الثدييات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية الدقيقة الأخرى ، مثل الخميرة والبكتيريا والحشرات ، بالإضافة إلى الحالة التي تنطوي على ضوابط انتقالية للتعبير الجيني. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث أن التعامل مع العينة المتعددة الأطراف لامتصاص الميكا وخطوات الغسيل أمر صعب للغاية ويتطلب مهارات وخبرات في المناولة. سيظهر الإجراء باولا برنابو ولورينزو لونيلي.
للبدء ، قم بجمع وتجميد أنسجة المخ كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. ثم اسحب المناديل المجمدة من الفريزر وأحضرها إلى المقعد. ضع أنسجة المخ المجمدة والنيتروجين السائل في ملاط مبرد مسبقا وسحقها باستخدام مدقة حتى تتشكل مسحوق.
انقل حوالي 25 ملليغراما من مسحوق الدماغ إلى أنبوب طرد مركزي بارد وأضف على الفور 0.8 مل من محلول التحلل. قم بعرض الخليط لأعلى ولأسفل 25 مرة بسرعة لتعطيل الخلايا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 12 ، 000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية لتكوير الحطام الخلوي.
انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد واحتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق لنوى الحبيبات والميتوكوندريا. بعد ذلك ، قم بإزالة ملليلتر واحد بعناية من أعلى تدرج السكروز المعد مسبقا.
تراكب السكروز قطرة قطرة مع المطاف من المحلل الخلوي. مع تحميل العينة الآن أعلى التدرج ، قم بخفض الأنبوب بعناية وأنبوب الموازنة في دلاء دوار دلو متأرجح. الطرد المركزي التدرج لمدة 100 دقيقة.
بعد الطرد المركزي الفائق ، اترك الأنابيب في دلائها لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، للسماح للتدرج بالاستقرار. بعد ذلك ، قم بإزالة أنبوب العينة بعناية وقم بتثبيته على جهاز التجميع لنظام تجزئة تدرج الكثافة. اجمع كسور مليلتر واحدة أثناء مراقبة امتصاص الأحماض النووية عند 260 نانومتر باستخدام كاشف الضوء المرئي للأشعة فوق البنفسجية وضعها على الجليد.
بعد ذلك ، قم بإعداد 30-40 ميكرولتر من الكسور ذات الأهمية ، واحتفظ بها على الجليد. إذا لم يتم استخدام العينات على الفور ، فقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية واتخذ خطوات للحد من عدد دورات التجميد والذوبان. لتحضير عينات لتصوير AFM ، قم أولا بتغطية ورقة الميكا المغسولة ب 200 ميكرولتر من كبريتات النيكل الثانية المليمولية واحتضان الورقة لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم قم بإزالة المحلول ، وجفف السطح بالهواء المضغوط ، وضع طبق بتري على الثلج. بعد ذلك ، أضف الحصة بأكملها برفق من جزء الفائدة قطرة قطرة على الميكا. باستخدام طرف 100 أو 200 ميكرولتر ، انشر العينة على كامل سطح الميكا ، واحتضن العينة على الجليد لمدة ثلاث دقائق.
بعد ذلك ، قم بتغطية ورقة الميكا قطرة قطرة ب 200 ميكرولتر من AFM البارد واحتضان العينة على الجليد لمدة ساعة واحدة. يعد الحفاظ على العينة عند 40 درجة واستخدام المخزن المؤقت البارد الذي تم تحضيره في ماء خال من RNase أمرا مهما للحفاظ على تنظيم البولي ريبوسوم. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت بعناية واغسل الميكا ثلاث إلى أربع مرات باستخدام 200 ميكرولتر من AFM البارد لإزالة أي سكروز زائد.
ثم اغسل الميكا ثلاث مرات بمحلول الغسيل البارد وصفي الماء الزائد من الميكا باستخدام الورق. تعد الإزالة الكاملة للسكروز من عينات المواد الماصة أمرا بالغ الأهمية الآن بعد أن قطعت كل من الريبوسوم والحمض النووي الريبي العاري في كثيرات الجسيم. اترك العينة لتجف تحت الغطاء الكيميائي مع فتح الجزء العلوي من طبق بتري جزئيا.
بعد ساعتين ، أغلق طبق بتري. يمكن الآن تخزين العينة في درجة حرارة الغرفة. قم بتوصيل العينة المحضرة بحامل عينة AFM باستخدام شريط على الوجهين.
بعد ذلك ، أدخل حامل العينة في مرحلة AFM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد المعايرة ، اقترب من العينة حتى يشبك طرف الكابولي السطح. حدد منطقة مسح ضوئي من اثنين في ميكرونين ، بدقة لا تقل عن 512 × 512 بكسل ، واختر وضع طرح الخلفية الحية ، وحدد مقياس Z من 20-25 نانومتر.
ثم ابدأ في الحصول على الصور. افحص الصورة ، وابحث عن وجود أجسام مستديرة تتميز بارتفاع يتراوح بين 10 و 15 نانومتر عند الحصول على صور في الهواء. بعد ذلك ، اضبط نقطة الضبط ومعلمات التغذية الراجعة حتى يتم تصور الكائنات الحادة.
يجب أن تظهر الخلفية مسطحة نسبيا في العينات الجيدة التي تحتوي على كائنات بارتفاع حوالي 2 إلى 4 نانومتر. بمجرد أن تبدو الصورة جيدة ، احصل على عدة عمليات مسح ضوئي اثنين في ميكرون في مناطق عينة مختلفة. بعد ترسب السكروز على الميكا ، يوفر AFM أوصافا دقيقة لحجم البوليسومات المفردة التي تظهر على شكل مجموعات من الريبوسومات المعبأة بإحكام.
يكشف إلقاء نظرة فاحصة على إحدى قمم الريبوسومات باستخدام تحليل المقطع العرضي أن ارتفاع قمم الريبوسومات يبلغ حوالي 14 نانومتر. يتطابق هذا مع ما لوحظ سابقا للريبوسومات البشرية والبوليزومات بعد التجفيف بالهواء. في الصورة الموجودة على اليمين ، تم استخدام ماكرو لتحديد موقع الريبوسوم وتمييز كل ريبوسوم بدائرة حمراء.
باستخدام هذه المعلومات ، يمكن تحليل توزيع التردد لعدد الريبوسومات لكل متعدد الجدول. تم تجهيز هذا التوزيع التجريبي بمنحنى غاوسي متمركز عند 5.8 ريبوسومات لكل بوليجسوم ، مع انحراف معياري قدره 1.3. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية من سحق الدماغ إلى الحصول على صور البولي ريبوسوم في أقل من ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إبقاء العينة على الجليد واستخدام المخازن الباردة لترسب العينة على الميكا. باتباع هذا الإجراء ، وباستخدام المكون الإضافي ImageJ الخاص بأحد المطورين لإتاحته في ورقتك ، يمكنك حساب عدد الريبوسوم بدقة لكل بوليجسوم. بعد كل تطور ، ستمهد هذه التقنية الطريق لفهم حركية تكوين كثرة الجبات وتحديد التغييرات في تنظيم تعدد الجسيمات وظروفها الخلوية أو الأنسجية المختلفة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على آلاف الصور متعددة الأشكال لتحليل منظمتهم ودراستهم بشكل منهجي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا مفصلًا لتصوير البوليسوومات في الثدييات باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). تسمح الطريقة بتصوير عالي الدقة دون الحاجة إلى تثبيت العينة أو وضع العلامات عليها.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- تنظيم البوليسوومات غير مستكشف بشكل جيد على الرغم من التوصيف المكثف لهيكل الريبوسوم.
- فهم تنظيم الريبوسوم ضروري للحصول على رؤى حول تنظيم التعبير الجيني.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الكائنات الحية، بما في ذلك الخميرة والبكتيريا.
- العرض المرئي ضروري نظرًا لتعقيد التعامل مع عينات البوليسوما.
هدف الدراسة
- تقديم بروتوكول موثوق لفصل وتصوير البوليريبوسوما في الدماغ.
- تسهيل دراسة التحكم في الترجمة والتعبير الجيني.
- تمكين التصوير في ظروف قريبة من الفسيولوجية.
الطرق المستخدمة
- مجهر القوة الذرية (AFM) للتصوير.
- فصل البوليريبوسوما في الدماغ على الميكا.
- التصوير دون معالجة لاحقة ثقيلة أو إعادة البناء ثلاثي الأبعاد.
- تقنيات المناولة لامتصاص العينة وغسلها.
النتائج الرئيسية
- تصوير ناجح للبوليريبوسوما بدقة النانومتر.
- تحديد الريبوسومات وخيوط الحمض النووي الريبي العارية في العينات.
- رؤى حول تنظيم البوليريبوسوما في الثدييات.
- تطبيقات محتملة في دراسة الضوابط الترجمة عبر مختلف الكائنات الحية.
الخلاصات
- يعزز البروتوكول فهم تنظيم الريبوسوم في البوليسوما.
- يوفر أداة قيّمة للباحثين الذين يدرسون التعبير الجيني.
- توسع قابلية تطبيق الطريقة للعديد من الكائنات الحية من تأثيرها.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Understanding polysome organization provides mechanistic insights into translational control, a critical layer of gene expression regulation relevant to target validation in neuroscience and metabolic disease programs. The ability to image polysomes in near-physiological conditions without fixation or labeling enables reproducible, quantitative analysis of ribosome dynamics, supporting early-stage hypothesis testing and biological de-risking. This approach offers a complementary, label-free method to assess translational states in disease-relevant systems, aiding in the prioritization of targets with strong mechanistic rationale.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of ribosome organization to interrogate translational hypotheses and clarify pathway-level effects of genetic or pharmacological perturbations.
- Operational Value: Provides a reproducible, label-free imaging readout that reduces variability associated with fixation or staining artifacts.
- Predictive Value: Supports assessment of translational state changes as a functional biomarker for target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative polysome imaging data suitable for high-content analysis of ribosome number and distribution.
- Reproducibility: Allows thousands of nanoscale-resolution images to be acquired under consistent conditions, enabling statistical robustness.
- Scalability: Compatible with fractionation workflows that can be adapted to multi-sample screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to brain tissue, enabling direct study of polysome organization in neurodegenerative and neuropsychiatric disease models.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to ex vivo brain systems, supporting mechanistic de-risking before in vivo validation.
- Cross-Species Utility: Can be extended to yeast, bacteria, and insects, allowing conservation studies and target validation across model organisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis validation through mechanistic de-risking, providing biophysical data on translational machinery organization that complements genomic and proteomic approaches.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking changes in polysome structure to translational control during gene expression rewiring.
- Analytics: Enables extraction of quantitative metrics such as ribosome count per polysome and spatial distribution, facilitating comparative analysis across conditions.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability for studying translational dynamics in diverse disease-relevant systems without reagent-dependent labeling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in translational control by providing direct nanoscale observation of polysome architecture.
- Operational Value: Eliminates need for fixation, labeling, or heavy post-processing, streamlining workflow and reducing variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by offering early, structure-function insights into target-mediated translational effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated translational mechanism in disease-relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polysome purification, density gradient fractionation, and AFM operation.
- Depends on access to ultracentrifugation, AFM instrumentation, and RNase-free buffer preparation.
- Necessitates standardized sample handling to ensure consistent deposition on mica and preservation of native polysome structure.
- Must account for tissue-specific variability in polysome yield and stability, particularly in post-mortem or frozen brain samples.
- Limited by the need for specialized training in sample preparation and AFM imaging techniques, as noted in the procedural demonstration requirement.
