يطل في الدماغ Polysomes مع مجهر القوة الذرية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير مسار عمل مفصل للتنقية الدقيقة وترسيب البوليريبوسومات الدماغية على الميكا، والحصول على آلاف الصور بدقة النانومتر دون الحاجة إلى معالجات لاحقة مكثفة أو تحليلات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات الترجمة والتحكم في الترجمة، مثل فهم تأثير تنظيم الريبوسومات داخل البوليسومات أثناء إعادة صياغة التعبير الجيني. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في عدم الحاجة إلى تثبيت العينة أو وسمها، وإمكانية إجراء القياسات في ظروف قريبة من الظروف الفسيولوجية لتسهيل تحديد الريبوسومات وخيوط الـ RNA العارية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول تنظيم الريبوسومات المتعددة في الثدييات، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على كائنات مجهرية أخرى، مثل الخميرة والبكتيريا والحشرات، بالإضافة إلى الحالات التي تتضمن ضوابط ترجمة التعبير الجيني. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث إن التعامل مع عينة الريبوسومات المتعددة للامتصاص على الميكا وخطوات الغسيل تكون دقيقة للغاية وتتطلب مهارات وخبرة في التعامل. وسيقوم Paola Bernabo و Lorenzo Lunelli بشرح هذا الإجراء.

للبدء، يتم جمع أنسجة الدماغ وتجميدها كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق. بعد ذلك، تُخرج الأنسجة المجمدة من المجمد وتوضع على طاولة المختبر. توضع أنسجة الدماغ المجمدة والنيتروجين السائل في هاون مبرد مسبقاً، ثم تُسحق باستخدام مدقة حتى تتحول إلى مسحوق.

انقل حوالي 25 milligrams من مسحوق الدماغ إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بارد، وأضف فوراً 0.8 milliliters من محلول التحلل (lysis buffer). استخدم الماصة لسحب الخليط ودفعه للأعلى والأسفل 25 مرة وبسرعة لتفكيك الخلايا. بعد ذلك، قم بوضع الأنبوب في جهاز الطرد المركزي عند 12, 000 x g لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة أربع درجات Celsius لترسيب الحطام الخلوي.

انقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد واحفظ الأنبوب على الثلج لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة خمس دقائق لترسيب النوى والميتوكوندريا. ثم، قم بإزالة 1 ml بعناية من الجزء العلوي لتدرج السكروز الذي تم تحضيره مسبقاً.

أضف الطافي من محلول التحلل السيتوزولي فوق السكروز قطرة بقطرة. بعد تحميل العينة على الجزء العلوي من التدرج، أنزل الأنبوب وأنبوب موازن بحذر في دلاء جهاز طرد مركزي ذو دوار متأرجح. قم بإجراء الطرد المركزي للتدرج لمدة 100 minutes.

بعد عملية الطرد المركزي الفائق، تُترك الأنابيب في الحوامل الخاصة بها لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، وذلك للسماح باستقرار التدرج. بعد ذلك، يُرفع أنبوب العينة بعناية ويُثبت في جهاز التجميع الخاص بنظام تجزئة تدرج الكثافة. يتم تجميع أجزاء بحجم 1 mL مع مراقبة امتصاص الأحماض النووية عند 260 nm باستخدام كاشف الضوء المرئي فوق البنفسجي، ثم تُوضع هذه الأجزاء على الثلج.

بعد ذلك، قم بتجهيز حصص قدرها 30-40 µL من الكسور ذات الأهمية، واحفظها على الثلج. وفي حال عدم استخدام العينات فوراً، تُخزن في درجة حرارة 80- درجة مئوية مع اتخاذ التدابير اللازمة للحد من عدد دورات التجميد والإذابة. ولتجهيز العينات لتصوير AFM، قم أولاً بتغطية شريحة ميكا مغسولة بـ 200 µL من كبريتات النيكل ii بتركيز 1 mM، واترك الشريحة لتحضن لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإزالة المحلول، وجفف السطح باستخدام الهواء المضغوط، ثم ضع طبق بتري على الثلج. بعد ذلك، أضف برفق كامل الجزء المأخوذ من الكسر المطلوب قطرة تلو الأخرى على الميكا. باستخدام طرف ماصة سعة 100 أو 200 µL، قم بتوزيع العينة على كامل سطح الميكا، واحضن العينة على الثلج لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك، قم بتغطية شريحة الميكا قطرة بقطرة بـ 200 microliters من محلول AFM المنظم البارد، ثم حضن العينة على الثلج لمدة ساعة واحدة. يعد الحفاظ على العينة في درجة حرارة 40 درجة واستخدام محلول منظم بارد تم تحضيره في ماء خالٍ من RNase أمراً هاماً للحفاظ على تنظيم البوليريبوسوم. بعد فترة التحضين، قم بإزالة المحلول المنظم بعناية واغسل الميكا من ثلاث إلى أربع مرات بـ 200 microliters من محلول AFM المنظم البارد لإزالة أي سكروز زائد.

بعد ذلك، اغسل الميكا ثلاث مرات بمحلول غسيل بارد وقم بتصريف المياه الزائدة من الميكا باستخدام الورق. إن الإزالة الكاملة للسكروز من العينات الممتصة تعد أمراً بالغ الأهمية الآن بعد أن قمت بفصل كل من الريبوسوم والـ RNA العاري في البوليسوم. اترك العينة لتجف تحت غطاء سحب الغازات الكيميائية مع فتح الجزء العلوي من طبق بتري جزئياً.

بعد مرور ساعتين، أغلق طبق بتري. يمكن الآن تخزين العينة في درجة حرارة الغرفة. قم بتثبيت العينة المُحضرة في حامل عينات AFM باستخدام شريط لاصق مزدوج الوجه.

بعد ذلك، قم بتركيب حامل العينة في منصة الـ AFM وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وبعد إجراء المعايرة، قم بتقريب المسبار من العينة حتى يتلامس طرف الكابولي مع السطح. اختر منطقة مسح تبلغ 2 × 2 ميكرون، وبدقة لا تقل عن 512 × 512 بكسل، ثم اختر وضع طرح الخلفية المباشر (live background subtraction mode)، وحدد مقياس Z يتراوح بين 20-25 نانومتر.

بعد ذلك، ابدأ عملية الحصول على الصور. افحص الصورة بحثًا عن وجود أجسام مستديرة تتميز بارتفاع يتراوح بين 10 و 15 nanometers عند التقاط الصور في الهواء. بعد ذلك، اضبط نقطة الضبط (set point) ومعاملات التغذية الراجعة حتى يتم تصور الأجسام بوضوح.

يجب أن تبدو الخلفية مسطحة نسبيًا في العينات الجيدة مع وجود بعض الأجسام التي يتراوح ارتفاعها بين 2 إلى 4 نانومتر. وبمجرد أن تبدو الصورة جيدة، يتم الحصول على عدة عمليات مسح بمقاس 2 × 2 ميكرون في مناطق مختلفة من العينة. بعد ترسيب حصص السكروز على الميكا، يوفر مجهر القوة الذرية (AFM) أوصافًا دقيقة لحجم البوليسومات المفردة التي تظهر كمجموعات من الريبوسومات المتراصة بإحكام.

يكشف الفحص الدقيق لإحدى القمم الريبوسومية باستخدام تحليل المقطع العرضي أن ارتفاع القمم الريبوسومية يبلغ حوالي 14 nanometers. وهذا يتطابق مع ما تم ملاحظته سابقاً للريبوسومات والبوليسومات البشرية بعد التجفيف بالهواء. وفي الصورة الموجودة على اليمين، تم استخدام برنامج مساعد (macro) لتحديد موقع الريبوسومات وتمييز كل ريبوسوم بدائرة حمراء.

باستخدام هذه المعلومات، يمكن تحليل التوزيع التكراري لعدد الريبوسومات لكل بوليوسوم. وقد تم مطابقة هذا التوزيع التجريبي مع منحنى غاوسي يتمركز عند 5.8 ريبوسوم لكل بوليوسوم، بانحراف معياري قدره 1.3. وبمجرد إتقانها، يمكن تنفيذ هذه التقنية، بدءاً من سحق الدماغ وصولاً إلى الحصول على صور البوليريبوسوم، في أقل من ثماني ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على العينة مبردة على الثلج واستخدام محاليل منظمة باردة لترسيب العينة على الميكا. باتباع هذا الإجراء، وباستخدام ملحق ImageJ الذي وفره المطور ليكون متاحاً في بحثك، يمكنك حساب عدد الريبوسومات في كل بولي سوم بدقة. وبعد كل تطوير، سيمهد هذا التكنيك الطريق لفهم حركية تكوين البولي سوم وتحديد التغيرات في تنظيم البولي سوم وظروفها الخلوية أو النسيجية المختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على الآلاف من صور البوليسوم من أجل تحليل ودراسة تنظيمها بشكل منهجي.