المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

الهدف العام لهذا البروتوكول هو إظهار التعديلات على بروتوكول CLARITY الأصلي ، والتي تؤدي إلى نتائج أكثر اتساقا وفعالية من حيث التكلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب ، مثل مورفولوجيا 3D ، والاتصال في الجهاز العصبي المركزي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تحسن اتساق المقاصة البصرية والفحص المجهري في الجهاز العصبي المركزي للفأر.

بطريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكاثر. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. نظرا لأن بناء غرفة التصوير معقد وغير واضح بسهولة من الوصف المكتوب.

الحصول على أنسجة الدماغ والحبل الشوكي الثابتة من الفئران التي تعبر عن البروتينات الفلورية. قم بتقطيع الدماغ عن طريق وضعه في مصفوفة دماغ فأر بلاستيكية وقطع خط الوسط بشفرة مصفوفة. أضف كل نصف كرة والحبل الشوكي لفصل أنابيب الطرد المركزي سعة 50 ملليلترا.

يحتوي كل منها على 40 مل من محلول الهيدروجيل. قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لحماية الفلوروفور. واحتضان الأنابيب التي تحتوي على عينات وهيدروجيل عند أربع درجات مئوية مع رج لطيف لمدة سبعة أيام.

بعد فترة الحضانة ، تخلص من 25 مل من الهيدروجيل ، تاركا العينة ، وحوالي 25 مل من الهيدروجيل في أنبوب الطرد المركزي. بعد ذلك ، قم بإزالة الأكسجين من العينة عن طريق إزالة الغطاء ، ووضع أنبوب الطرد المركزي في وعاء مجفف ، وتوصيل البرطمان بالفراغ. ضع المكنسة الكهربائية لمدة 10 دقائق على الأقل.

رج العبوة برفق لإخراج فقاعات الأكسجين المنبعث. بعد 10 دقائق ، استبدل الفراغ الموجود في وعاء المجفف بغاز نيتروجين بنسبة 100٪ على مدار دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بمجرد أن يتساوي الضغط ويمكن فتح الجزء العلوي من وعاء المجفف ، قم بتغطية الأنبوب بسرعة لمنع إعادة إدخال الأكسجين.

بعد ذلك ، قم ببلمرة الهيدروجيل عن طريق وضع الأنبوب مع العينة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات حتى تكتمل البلمرة. بعد ثلاث ساعات ، سيأخذ الهيدروجيل المبلمر قواما يشبه الهلام. استخدم ملعقة لإزالة العينة المبلمرة من أنبوب الطرد المركزي ثم قم بقطع الهيدروجيل الزائد من العينة.

أخيرا ، قم بإزالة الهيدروجيل المتبقي عن طريق وضع العينة على منديل خال من الوبر ، وفرك الأنسجة عليها برفق ولفها ، تاركا وراءها طبقة رقيقة فقط من الهيدروجيل المبلمر على العينة. لبدء عملية إزالة الدهون ، انقل العينة المبلمرة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 مليلتر مع 45 مل من محلول المقاصة ، واحتضانه عند 45 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف لمدة سبعة أيام. قم بتغيير المخزن المؤقت يوميا خلال فترة الأيام السبعة الأولى هذه عن طريق سكب مخزن الإزالة المستخدم في حاوية النفايات الكيميائية.

وإضافة 45 مل من مخزن المقاصة الطازج. بمجرد إذابة جميع الدهون ووصول الأنسجة إلى الشفافية ، انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مليلتر مملوء ب 45 مل من PBST ، واغسلها أربع مرات عند 40 درجة مئوية مع رج لطيف خلال ال 24 ساعة القادمة ، لإزالة SDS المتبقي. بعد الغسيل النهائي ل PBST ، انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 15 مليلتر مملوء بميكروغرام واحد لكل مليلتر DAPI و 1xPBST.

لفها بورق القصدير واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، اغسل ثلاث مرات في PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات على الأقل لكل غسلة. ثم انتقل إلى مطابقة معامل الانكسار.

لبدء هذا الجزء من الإجراء ، انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 15 مليلتر مملوء ب 2-2 ثيوديثانول و 1xPBS عند PH 7.5 واحتضانه كما هو موضح على الشاشة. قرب نهاية الحضانة الثانية ، قم بإنشاء غرفة وتصويرها عن طريق دحرجة قطعة من المادة اللاصقة القابلة لإعادة الاستخدام في أسطوانة بقطر موحد أكبر قليلا من سمك العينة. ضع الأسطوانة في دائرة مفتوحة على طبق زجاجي سفلي مقاس 40 ملم.

ثم استخدم طرف ماصة P1000 لإنشاء مانع تسرب بين المادة اللاصقة القابلة لإعادة الاستخدام والزجاج عن طريق لفها حول الحافة الخارجية للأسطوانة. الماصة ما يقرب من 100 ميكرولتر من 63٪ TDE على الطبق الزجاجي ونشرها لتغطية السطح الزجاجي داخل دائرة المادة اللاصقة القابلة لإعادة الاستخدام. ثم استخدم ملعقة لوضع العينة بعناية في منتصف الدائرة مع الحرص على عدم تكوين فقاعات.

بعد ذلك، ضع ماصة 100 ميكرولتر أخرى من 63٪ TDE مباشرة على العينة، ثم ضع على الفور غطاء زجاجي دائري مقاس 40 مم فوق المادة اللاصقة القابلة لإعادة الاستخدام. استخدم السبابة والوسطى والبنصر لكلتا يديك للضغط بعناية حول محيط الدائرة حتى يتلامس زجاج الغطاء مع العينة. الآن ، قم بإحضار الطبق السفلي الزجاجي ببطء إلى وضع رأسي على سطح ، ثم أضف 63٪ TDE باستخدام ماصة حتى يصل المحلول إلى الفتحة الصغيرة في الأعلى.

استخدم منديلا خاليا من الوبر لتجفيف طرف الماصة حتى لا يتساقط المحلول على الزجاج. أخيرا ، أضف المطاط الصناعي من السيليكون إلى الفتحة الصغيرة لإحاطة الدائرة وإنشاء غرفة مغلقة. انتظر خمس دقائق حتى يجف ، ثم انتقل إلى التصوير.

ضع غرفة التصوير مع العينة بداخلها على مسرح المجهر متحد البؤر بالمسح بالليزر. افتح برنامج التصوير ، لتشغيل ليزر إثارة الأرجون ، انقر فوق علامة تبويب التكوين في الجزء العلوي من البرنامج ، ثم أيقونة الليزر. حدد المربع الموجود بجوار الأرجون لتشغيل الليزر وتحريك مقياس الشريحة إلى 30٪ ارجع إلى علامة تبويب الاستحواذ في الأعلى.

في مربع إعدادات مسار الشعاع، انتقل إلى مربع إعداد توفير الحمل، وحدد القائمة المنسدلة لتحديد قناة الطول الموجي المناسبة لإصدار YFP. في مربع إعدادات القناة، حدد الأهداف المناسبة للتصوير بالنقر فوق الارتباط التشعبي الأحمر المسمى الكائن الحالي الموضوعي. استخدم أهدافا بمسافة عمل أكبر من سمك الأنسجة.

وفتحة عددية كبيرة لزيادة دقة الصورة الداخلية إلى أقصى حد ، وتقليل سمك المقطع البصري. في العمود الأيسر من القوائم المنسدلة ، افتح نافذة دقة XY لتعيين مصفوفة الاستحواذ ، المسماة التنسيق على 1024 × 1024 أو قيمة مناسبة لحد الدقة الجانبية للهدف. اضبط عامل التكبير/التصغير على أدنى مستوى ممكن.

1.7 يستخدم هنا. في نفس النافذة ، قم بتعيين متوسط السطر الثامن ومتوسط إطار واحد عن طريق إسقاط القوائم المسماة بشكل فردي وفقا لذلك. حدد موقع العينة باستخدام عناصر التحكم في المرحلة.

بمجرد أن يصبح الحقل التمثيلي مرئيا، اضبط الكسب على ما بين 760 إلى 780، والإزاحة إلى ما بين 1.0 و1.5 ل YFP. حدد فحص البلاط. ثم قم بتعيين الحدود العليا والدنيا لمكدس Z المراد الحصول عليه.

قم بتعيين سمك القسم البصري بناء على أهداف الحد الدقة للقسم البصري ثم ابدأ عملية الاستحواذ. تظهر هذه الصورة الخلايا العصبية الإيجابية YFP في القشرة الدماغية والحصين التي تم تصويرها على أنها تكبير 5x وأعيد بناؤها في 3D. يمثل شريط المقياس ملليمترا واحدا.

يوضح هذا الإسقاط الأقصى للكثافة لكومة صور 10x من القشرة الدماغية الإجهاض الشجيري للطبقة القشرية الخامسة من الخلايا العصبية الهرمية. هنا يمثل شريط المقياس 100 ميكرون. يظهر هنا تعبير THY-1YFP في الحبل الشوكي العنقي والصدري السليم ، وتم تصويره بتكبير 5x ، وأعيد بناؤه في 3D.

يمثل شريط المقياس ملليمترين. أخيرا ، يوضح هذا الإسقاط الأقصى للكثافة لكومة مصورة 10x من الحبل الشوكي المحاور الفردية ، وتمثل أشرطة المقياس 100 ميكرون. إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، فيمكن إجراء هذه التقنية في غضون أسبوعين إلى أربعة أسابيع للحبل الشوكي الكامل ، وأربعة إلى ستة أسابيع للأدمغة المنقسمة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تشكيل طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية من أجل الإجابة على الأسئلة التي تتطلب تنميطا ظاهريا كيميائيا حيويا أكثر تعقيدا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مسح وتصوير الجهاز العصبي المركزي للفأر. باستخدام الوضوح السلبي ، والفحص المجهري متحد البؤر بالليزر.