المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توضيح تعديلات على بروتوكول CLARITY الأصلي، والتي تؤدي إلى نتائج أكثر اتساقاً وفعالية من حيث التكلفة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في علوم الأعصاب، مثل المورفولوجيا ثلاثية الأبعاد والترابط في الجهاز العصبي المركزي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تحسن من اتساق الترويق الضوئي والفحص المجهري في الجهاز العصبي المركزي للفأر.

بطريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكرار. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، نظراً لأن بناء غرفة التصوير معقد وغير واضح تماماً من خلال الوصف المكتوب.

يتم الحصول على أنسجة الدماغ والنخاع الشوكي المثبتة ببارافورمالدهيد من فئران تعبر عن بروتينات فلورية. يتم تقسيم الدماغ إلى نصفين عن طريق وضعه في قالب بلاستيكي مخصص لدماغ الفئران والقطع على طول الخط الناصف باستخدام شفرة القالب. يُضاف كل نصف كرة دماغية والنخاع الشوكي إلى أنابيب طرد مركزي منفصلة سعة 50 milliliter.

بحيث يحتوي كل منها على 40 milliliters من محلول الهيدروجيل. غطِّ الأنابيب بورق ألومنيوم لحماية الفلوروفورات. ثم قم بتحضين الأنابيب التي تحتوي على العينات والهيدروجيل عند درجة حرارة four degrees celsius مع الرج اللطيف لمدة سبعة أيام.

بعد انتهاء فترة الحضن، تخلص من 25 ملليلتر من الهيدروجيل مع ترك العينة وما يقرب من 25 ملليلتر من الهيدروجيل في أنبوب الطرد المركزي. بعد ذلك، قم بإزالة الأكسجين من العينة عن طريق نزع الغطاء، ووضع أنبوب الطرد المركزي في وعاء تجفيف، وتوصيل الوعاء بمضخة تفريغ. قم بتطبيق التفريغ لمدة 10 دقائق على الأقل.

رجّ الوعاء برفق للتخلص من فقاعات الأكسجين المنبعثة. بعد مرور 10 دقائق، استبدل الفراغ في جرة المجفف بغاز النيتروجين بنسبة 100% على مدار دقيقتين إلى ثلاث دقائق. وبمجرد تعادل الضغط وإمكانية فتح الجزء العلوي من جرة المجفف، أغلق الأنبوب بسرعة لمنع إعادة دخول الأكسجين.

بعد ذلك، يتم بلمرة الهيدروجيل عن طريق وضع الأنبوب الذي يحتوي على العينة في حمام مائي عند 37 degrees celsius لمدة ثلاث ساعات حتى تكتمل عملية البلمرة. بعد مرور ثلاث ساعات، سيكتسب الهيدروجيل المبلمر قواماً هلامياً. استخدم ملعقة مسطحة (spatula) لإزالة العينة المبلمرة من أنبوب الطرد المركزي، ثم قم بقص الهيدروجيل الزائد عن العينة.

أخيرًا، قم بإزالة الهيدروجيل المتبقي عن طريق وضع العينة على منديل خالٍ من الوبر، وفرك النسيج وتدويره عليه بلطف، بحيث لا تتبقى سوى طبقة رقيقة من الهيدروجيل المبلمر على العينة. لبدء عملية إزالة الدهون، انقل العينة المبلمرة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 milliliter يحتوي على 45 milliliters من محلول التصفية المنظم (clearing buffer)، واحضنها عند 45 degrees celsius مع الرج اللطيف لمدة سبعة أيام. قم بتغيير المحلول المنظم يوميًا خلال فترة السبعة أيام الأولية هذه عن طريق سكب محلول التصفية المستخدم في حاوية النفايات الكيميائية.

ثم يُضاف 45 milliliters من محلول الترويق الطازج. وبمجرد ذوبان جميع الدهون ووصول النسيج إلى حالة الشفافية، يتم نقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 milliliter مملوء بـ 45 milliliters من PBST، وتُغسل أربع مرات عند 40 degrees celsius مع الرج اللطيف على مدار الـ 24 ساعة التالية لإزالة ما تبقى من SDS. وبعد غسلة PBST النهائية، تُنقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 15 milliliter مملوء بـ 1 microgram per milliliter من DAPI و 1xPBST.

يُغطى بورق القصدير ويُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. وفي اليوم التالي، يُغسل ثلاث مرات بمحلول PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات على الأقل لكل غسلة. ومن ثم يتم الانتقال إلى عملية مطابقة معامل الانكسار.

لبدء هذا الجزء من الإجراء، انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 15 milliliter مملوء بـ 2-2 thiodiethanol و 1xPBS عند PH 7.5 وقم بالتحضين كما هو موضح على الشاشة. وقبيل نهاية فترة التحضين الثانية، قم بإنشاء غرفة تصوير عن طريق لف قطعة من اللاصق القابل لإعادة الاستخدام على شكل أسطوانة ذات قطر موحد يكون أكبر بقليل من سمك العينة. ضع الأسطوانة على شكل دائرة مفتوحة الطرفين في طبق ذو قاعدة زجاجية بقطر 40 millimeter.

بعد ذلك، استخدم رأس ماصة P1000 لإنشاء سدادة بين المادة اللاصقة القابلة لإعادة الاستخدام والزجاج عن طريق تدويرها حول الحافة الخارجية للأسطوانة. انقُل ما يقرب من 100 µL من 63%TDE باستخدام الماصة على الطبق الزجاجي ووزعها لتغطية السطح الزجاجي داخل دائرة المادة اللاصقة القابلة لإعادة الاستخدام. ثم استخدم ملعقة مسطحة (spatula) لوضع العينة بعناية في منتصف الدائرة مع الحرص على عدم تكوين فقاعات.

بعد ذلك، انقل 100 µL أخرى من 63%TDE بالماصة مباشرة فوق العينة، وضع على الفور غطاءً زجاجياً دائرياً بقطر 40 millimeter فوق المادة اللاصقة القابلة لإعادة الاستخدام. استخدم أصابع السبابة والوسطى والببنسر في كلتا اليدين للضغط بعناية حول محيط الدائرة حتى يلامس الغطاء الزجاجي العينة. الآن، ارفع الطبق ذو القاعدة الزجاجية ببطء إلى وضع عمودي بحيث يستند إلى سطح ما، ثم أضف 63%TDE باستخدام الماصة حتى يصل المحلول إلى الفتحة الصغيرة الموجودة في الأعلى.

استخدم ممسحة خالية من الوبر لتجفيف طرف الماصة حتى لا يقطر المحلول على الزجاج. وأخيراً، أضف مطاط السيليكون (silicon elastomer) إلى الفتحة الصغيرة لإغلاق الدائرة وإنشاء غرفة مغلقة. انتظر خمس دقائق للجفاف، ثم انتقل إلى عملية التصوير.

ضع غرفة التصوير وبداخلها العينة على منصة مجهر كونفوكال ماسح بالليزر. افتح برنامج التصوير، ولتشغيل ليزر الإثارة بالأرغون، انقر فوق علامة تبويب التكوين (configuration) في أعلى البرنامج، ثم أيقونة الليزر. حدد المربع المجاور للأرغون لتشغيل الليزر وحرك مقياس الشريحة إلى 30% ثم عد إلى علامة تبويب الاستحواذ (acquire) في الأعلى.

في مربع إعدادات مسار الشعاع، انتقل إلى مربع إعدادات التحميل والحفظ (load-save setting)، واختر من القائمة المنسدلة قناة الطول الموجي المناسبة لإصدار البروتين الفلوري الأصفر YFP. وفي مربع إعدادات القناة، اختر العدسات الشيئية المناسبة للتصوير من خلال النقر على الارتباط التشعبي الأحمر المسمى objective current object. استخدم عدسات شيئية تكون مسافة العمل فيها أكبر من سمك النسيج.

وفتحة عددية كبيرة لزيادة دقة الصورة في المستوى إلى أقصى حد، ولتقليل سمك المقطع البصري. في العمود الأيسر من القوائم المنسدلة، افتح نافذة دقة XY لضبط مصفوفة الاستحواذ، المسماة التنسيق (format)، على 1024x1024 أو قيمة مناسبة لحد الدقة الجانبية للعدسة الشيئية. اضبط عامل التكبير على أقل قيمة ممكنة.

تُستخدم القيمة 1.7 هنا. وفي النافذة ذاتها، قم بضبط معايير متوسط السطر الثامن (eighth line average) ومتوسط الإطار الواحد (one frame average) من خلال القوائم المنسدلة المخصصة لكل منهما. حدد موقع العينة باستخدام أدوات التحكم في المنصة.

بمجرد ظهور حقل رؤية ممثل، اضبط الكسب (gain) ليكون بين 760 و780، والإزاحة (offset) لتكون بين 1.0 و1.5 لبروتين YFP. اختر المسح المربعي (tile scan)، ثم حدد الحدود العليا والسفلى لمجموعة الصور المحورية (Z stack) المراد الحصول عليها.

حدد سمك المقطع البصري بناءً على حد دقة المقطع البصري للعدسة الشيئية، ثم ابدأ عملية الاستحواذ. تُظهر هذه الصورة العصبونات الموجبة لـ YFP في القشرة المخية والحصين، وقد تم تصويرها بتكبير 5x وإعادة بنائها ثلاثية الأبعاد (3D). يمثل شريط القياس مليمتر واحد.

يوضح هذا الإسقاط لأقصى كثافة لمجموعة صور مكدسة بعشرة أضعاف (10x) للقشرة المخية التشجر الشجيري للعصبونات الهرمية في الطبقة الخامسة من القشرة. يمثل شريط المقياس هنا 100 microns. يظهر هنا تعبير THY-1YFP في نخاع شوكي عنقي وصدري سليم، تم تصويره بتكبير 5x وإعادة بنائه ثلاثي الأبعاد (3D).

يمثل شريط المقياس مليمترين. وأخيرًا، يوضح هذا الإسقاط ذو الكثافة القصوى لمجموعة صور مكدسة للنخاع الشوكي تم تصويرها بقوة تكبير 10x المحاور العصبية الفردية، حيث تمثل أشرطة المقياس 100 ميكرون. إذا تم تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح، فيمكن إتمامها في غضون أسبوعين إلى أربعة أسابيع للنخاع الشوكي الكامل، ومن أربعة إلى ستة أسابيع للأدمغة المقطوعة نصفياً.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية للإجابة على الأسئلة التي تتطلب توصيفاً كيميائياً حيوياً أكثر تعقيداً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الترويق البصري وتصوير الجهاز العصبي المركزي للفأر، باستخدام تقنية passive clarity والمجهر البؤري الليزري.