متلازم الضوء والمجهر الإلكتروني لدراسة دبقية التفاعل مع اللوحات-β اميلويد
June 1st, 2016
توضح هذه المقالة بروتوكول لتصور اميلويد لويحات Aβ في نماذج الفئران مرض الزهايمر باستخدام ميثوكسي-X04، الذي يعبر حاجز الدم في الدماغ وبشكل انتقائي يربط بيتا-مطوي أوراق وجدت في لويحات Aβ نواة كثيفة. فإنه يسمح الفرز المسبق من أقسام الأنسجة التي تحتوي على لوحة قبل المناعية وتجهيز المجهر الإلكتروني.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد لويحات بيتا أميلويد في أقسام الدماغ من نماذج الفئران لمرض الزهايمر قبل التضمين المسبق للتلطيخ المناعي ومعالجة الأنسجة للفحص المجهري الإلكتروني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة العصبية مثل تفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة مع المشابك العصبية بالقرب من مخططات بيتا النشوانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بفحص أقسام أنسجة المخ التي تحتوي على قطع بيتا الأميلويد في المناطق والطبقات ذات الاهتمام.
على الرغم من أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة على مرض الزهايمر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أي أمراض أو أنسجة أخرى يوجد بها الداء النشواني. أولا ، قم بإعداد محلول خمسة ملليغرام لكل مليلتر من مركب الميثوكسي X04. باستخدام ميزان ميركو ، قم بوزن خمسة ملليغرامات من الميثوكسي X04.
تحت غطاء الدخان ، قم بإذابة الميثوكسي X04 في 100 ميكرولتر من DMSO وحرك حتى يتم الحصول على محلول أخضر شفاف. أضف على التوالي 450 ميكرولتر من البروبيلين جلايكول و 450 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات أثناء التحريك. حافظ على خلط المحلول عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
في اليوم التالي ، يجب رؤية مستحلب أخضر مصفر. بعد حقن الميثوكسي X04 ، أضف جرعة 10 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم والتضحية بالحيوان في النقطة الزمنية المطلوبة وفقا للطرق المعتمدة ، اغسل الدماغ الثابت بالمالديهايد ثلاث مرات باستخدام PBS المبرد. بعد ذلك ، باستخدام شفرة حلاقة حادة ، قم بإزالة البصلة الشمية وقطع الدماغ إكليليا إلى قطعتين إلى ثلاث قطع متساوية الارتفاع تقريبا ، ويمكن تقسيمها جميعا في وقت واحد من أجل تسريع الإجراء.
ألصق قطع أنسجة المخ على لوحة العينة المثبتة في الدرج. تأكد من أن السطح المقطوع الأملس يلتصق بقوة بلوحة العينة. أضف محلول PBS إلى الدرج حتى يتم غمر سطح الدماغ بالكامل بالكامل.
ضع الدرج في الاهتزاز واضبط إعدادات الاهتزاز لإنتاج أقسام بسمك 50 ميكرون. ابدأ في القطع ، وإذا كان الفحص ، انقل الأقسام على الفور إلى PBS باستخدام فرشاة رسم دقيقة. بدلا من ذلك ، يمكن وضع الأقسام في قوارير زجاجية تحتوي على محلول محمي بالتبريد للتخزين عند 20 درجة مئوية.
بمساعدة أطلس دماغ الفأر التجسيمي ، حدد أقسام الدماغ التي تحتوي على منطقة الاهتمام وضع كل قسم في مادة التبريد في بئر من لوحة ثقافة مكونة من 24 بئرا. بعد ذلك ، استخدم ماصة يمكن التخلص منها لإضافة قطرة من PBS على شريحة مجهرية ثم ضع القسم على القطرة. افحص القسم تحت المجهر الفلوري لتحديد المناطق التي تحتوي على لويحات ميثوكسي X04 المسماة a-beta.
بدون تحريك مرحلة المجهر ، التقط صورا للمناطق ذات الأهمية في المجال الساطع وكذلك في وضع التألق. يجب أن تظهر كل صورة نفس المنطقة في كلا المجالين لربط اللويحة بالمنطقة الهيكلية لقسم الأنسجة. احفظ الصور الملتقطة وتسميتها وفقا لرقم.
قم أيضا بتسجيل رقم البئر في اللوحة وحقل الصور الملتقطة. ضع القسم مرة أخرى في البئر المخصص بمجرد اكتمال التصوير. افحص القسم التالي في التسلسل باستخدام نفس الإجراء لتجنب تجفيف الأقسام.
لمحاذاة الصور، افتح الحقل الساطع وصور مجال الأشعة فوق البنفسجية لنفس عائد الاستثمار في ImageJ. بعد ذلك ، استخدم المكون الإضافي MosaicJ لمحاذاة حواف الصورتين. احفظ الصورة المحاذاة والمدمجة وفقا لرقم البئر في مجلد برقم معين.
اجمع بين الصور من أقسام مختلفة من نفس لتحديد وتوطين اللويحات في المنطقة ذات الاهتمام. بعد اكتمال عملية الفحص ، قم بتخزين الأقسام التي تم فحصها عند 20 درجة مئوية عبارة عن صفيحة مزرعة مكونة من 24 بئرا تحتوي على مادة لاصقة بالتبريد حتى يتم إجراء تلطيخ مناعي أو مزيد من المعالجة. أولا ، قم بإعداد محلول رابع أكسيد الأوزميوم 1٪ في عازلة الفوسفات في قارورة زجاجية.
نظرا لأن رباعي أكسيد الأوزميوم حساس للضوء ، قم بتغطية القارورة الزجاجية بورق الألمنيوم لحماية المحلول من الضوء. بعد الغسيل في عازلة الفوسفات ، قم بإزالة المخزن المؤقت من الأقسام وانشرها بشكل مسطح باستخدام فرشاة رسم دقيقة. تأكد من تسطيح الأقسام مباشرة قبل إضافة رابع أكسيد الأوزميوم لأن أي طيات في الأقسام ستصبح دائمة ومحاولة تسطيح الأنسجة بعد تثبيت الأوزميوم لن تؤدي إلا إلى كسر الأقسام.
استخدم ماصة نقل لإضافة رابع أكسيد الأوزميوم إلى الأقسام قطرة واحدة في كل مرة حتى يتم غمر القسم. غطي البئر بورق الألمنيوم لحماية الأقسام من الضوء واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلال هذه الحضانة ، قم بإعداد الراتنج البلاستيكي في دورق يمكن التخلص منه.
امزج المكونات معا بالترتيب واخلطها جيدا باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر حتى يتم الحصول على لون موحد. انقل الخليط المحضر إلى أطباق الوزن المصنوعة من الألومنيوم. ستتلقى هذه أقسام الأنسجة بمجرد تجفيفها.
بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، قم بتجفيف الأقسام بتركيزات متزايدة من الإيثانول لمدة دقيقتين لكل منهما. انقل الأقسام المجففة من لوحة الثقافة المكونة من 24 بئرا إلى قوارير زجاجية سعة 20 مل. ثم اغمر الأقسام في أكسيد البروبيلين ثلاث مرات لمدة دقيقتين في كل مرة لإزالة الإيثانول المتبقي.
بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة زجاجية مثنية أو فرشاة رسم دقيقة لنقل الأقسام من محلول أكسيد البروبيلين إلى الراتنج البلاستيكي واتركها طوال الليل للتسلل في درجة حرارة الغرفة. بعد التسلل ، ضع أطباق الوزن المصنوعة من الألومنيوم التي تحتوي على العينات في فرن من 50 إلى 60 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. لتضمين أقسام على صفائح فيلم بولي كلورو ثلاثي فلورو إيثيلين ، استخدم أولا فرشاة رسم دقيقة لطلاء طبقة رقيقة من الراتنج على القسم.
بعد ذلك ، انقل قسما واحدا من الأنسجة في كل مرة من طبق وزن من الألومنيوم إلى لوح فيلم PCTFE. قم بإزالة الراتنج الزائد من حول الأنسجة ، مع الحرص على عدم إزعاجه. بعد نقل جميع الأقسام من طبق وزن واحد إلى لوح فيلم PCTFE ، ضع ورقة PCTFE ثانية فوق الأولى لإنشاء شطيرة من المناديل والراتنج بين الورقتين.
بلمرة الراتنج في حاضنة لمدة ثلاثة أيام عند 55 إلى 60 درجة مئوية. ثم تكون الأنسجة جاهزة للتقطيع الرقيق للغاية وفحص البنية الفوقية. تظهر الصور التالية تصويرا مزدوجا لقسم واحد من الحصين باستخدام أوضاع المجال الساطع والفلورة.
يتم تصور المناطق والطبقات ذات الأهمية تحت مجال ساطع. بينما يتم توطين لويحات a-beta بنجاح باستخدام مرشح الأشعة فوق البنفسجية في نطاق 340 إلى 380 نانومتر. تظهر هذه الصورة قسما من الحصين قبل التضمين المسبق للتلطيخ المناعي ل IBA1.
يتم تحديد لوحة مرئية بواسطة الخط المنقط. تظهر هذه الصورة نفس القسم بعد التضمين المسبق للتلطيخ المناعي ل IBA1 ومعالجة الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. لاحظ أن اللويحة المحاطة بخط منقط لا تزال مرئية عند معالجة الأنسجة للفحص المجهري الإلكتروني.
بمجرد إتقان هذا البروتوكول ، يمكن إكمال هذا البروتوكول في أسبوع واحد إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب القيام بكل خطوة بدقة لتقليل احتمالية التلوث والتدهور الهيكلي الآخر الذي سيؤثر على جودة العينات. لا تنس أن العمل باستخدام الأوزميوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذا يجب عليك دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
تأكد من التخلص منها بعد الاستخدام في نهاية تجربتك وفقا لإرشادات منشأتك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة بروتوكولا لتصور لويحات أميلويد Aβ في نماذج الفئران لمرض الزهايمر باستخدام ميثوكسي-X04. تسمح هذه الطريقة بالفحص المسبق للأقسام النسيجية المحتوية على اللويحات قبل التلطيخ المناعي وتجهيزها لمجهر الإلكترون.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم المناعة العصبية
- بحوث مرض الزهايمر
الخلفية
- ترتبط لويحات Aβ بمرض الزهايمر.
- فهم التفاعلات بين الخلايا الدبقية الصغيرة والمشابك العصبية أمر بالغ الأهمية.
- يرتبط الميثوكسي-X04 بشكل انتقائي بالصفائح بيتا المطوية في لويحات Aβ.
- يمكن تطبيق هذه التقنية على أمراض أخرى مع الإصابة بالداء النشواني.
غرض الدراسة
- تحديد لويحات بيتا-أميلويد في أقسام الدماغ.
- تسهيل التلطيخ المناعي قبل التجهيز.
- تعزيز تجهيز الأنسجة لميكروسكوب الإلكترون.
الطرق المستخدمة
- تحضير محلول الميثوكسي-X04 (5 ملغ/مل).
- وزن الميثوكسي-X04 باستخدام ميزان دقيق.
- تطبيق المحلول على أقسام أنسجة الدماغ.
- تصور لويحات الأميلويد قبل التجهيز الإضافي.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح للويحات Aβ في نماذج الفئران.
- تحديد مناطق الاهتمام للدراسة الإضافية.
- تسهيل التلطيخ المناعي وميكروسكوب الإلكترون.
- إمكانية التطبيق على حالات أخرى متعلقة بالداء النشواني.
الاستنتاجات
- تعتبر طريقة الميثوكسي-X04 فعالة للفحص المسبق للويحات.
- تساعد هذه التقنية في فهم التفاعلات المناعية العصبية.
- لها تطبيقات أوسع من مرض الزهايمر.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables early identification of amyloid plaques in brain tissue, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By pre-screening for plaque-containing sections, it reduces wasted effort in downstream immunostaining and ultrastructural analysis. The method enhances predictive confidence in microglial–plaque interaction studies, informing go/no-go decisions in Alzheimer’s disease target de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial localization relative to amyloid plaques to test neuroinflammatory hypotheses.
- Operational Value: Prescreens tissue sections to focus resources on regions with detectable plaques, improving efficiency in target validation workflows.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by confirming plaque presence before investing in time-intensive EM and immunostaining procedures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses methoxy-X04 fluorescence to generate quantitative plaque localization data compatible with correlative imaging.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible section selection criteria for downstream EM preparation.
- Assay Readiness: Generates archived, cryoprotected sections suitable for batch processing in immunostaining and resin embedding pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains plaque visibility through EM processing, enabling ultrastructural correlation with fluorescently labeled microglia.
- Disease Model Fidelity: Applicable to amyloidopathy models beyond Alzheimer’s, supporting broad target validation in protein misfolding diseases.
- <Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions based on plaque burden and regional distribution before committing to therapeutic intervention studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, specifically enabling efficient progression from plaque detection to microglial interaction analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial–amyloid plaque spatial relationships in defined brain regions.
- Screening: Enables reproducible selection of plaque-positive sections, reducing variability in immunostaining and EM sample preparation.
- Analytics: Generates correlated brightfield and fluorescence image datasets for quantitative plaque burden and co-localization analysis.
- Translational Research: Preserves plaque integrity through EM processing, allowing structural validation of fluorescently identified targets.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable pre-screening platform for amyloid detection across multiple disease models and target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by confirming amyloid presence prior to mechanistic studies.
- Operational Value: Reduces reagent and instrument workload by excluding plaque-negative sections from downstream processing.
- Strategic Value: Improves capital efficiency in neurodegenerative target programs by minimizing failed experiments due to low plaque yield.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified target prioritization based on plaque burden and regional specificity in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent microscopy, vibratome sectioning, and EM sample preparation.
- Dependent on access to methoxy-X04, DMSO, propylene glycol, and osmium tetroxide with appropriate safety controls.
- Necessitates standardized sectioning and staining protocols to ensure plaque detection consistency across operators and sites.
- Adaptation to non-murine models may require optimization of dosing, perfusion, and section thickness.
- Plaque detection sensitivity is limited by methoxy-X04 binding affinity and tissue autofluorescence in certain brain regions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Methoxy-X04 Solution Preparation and Injection
1:52
Brain Sectioning Using a Vibratome
3:21
Screening for the Presence of Methoxy-X04-stained Plaques
5:40
Tissue Processing for Electron Microscopy
9:01
Results: Visualization of Aβ Plaques in 21-month-old APP-PS1 Mice Using Light Microscopy Following Systemic Injection of the Fluorescent Dye Methoxy-X04
10:01
Conclusion
![تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56279.jpg%3Fv%3D2026-07-04T00%253A28%253A46.000Z&w=384&q=75)
