متلازم الضوء والمجهر الإلكتروني لدراسة دبقية التفاعل مع اللوحات-β اميلويد

توضح هذه المقالة بروتوكول لتصور اميلويد لويحات Aβ في نماذج الفئران مرض الزهايمر باستخدام ميثوكسي-X04، الذي يعبر حاجز الدم في الدماغ وبشكل انتقائي يربط بيتا-مطوي أوراق وجدت في لويحات Aβ نواة كثيفة. فإنه يسمح الفرز المسبق من أقسام الأنسجة التي تحتوي على لوحة قبل المناعية وتجهيز المجهر الإلكتروني.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد لويحات بيتا أميلويد في أقسام الدماغ من نماذج الفئران لمرض الزهايمر قبل التضمين المسبق للتلطيخ المناعي ومعالجة الأنسجة للفحص المجهري الإلكتروني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة العصبية مثل تفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة مع المشابك العصبية بالقرب من مخططات بيتا النشوانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بفحص أقسام أنسجة المخ التي تحتوي على قطع بيتا الأميلويد في المناطق والطبقات ذات الاهتمام.

على الرغم من أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة على مرض الزهايمر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أي أمراض أو أنسجة أخرى يوجد بها الداء النشواني. أولا ، قم بإعداد محلول خمسة ملليغرام لكل مليلتر من مركب الميثوكسي X04. باستخدام ميزان ميركو ، قم بوزن خمسة ملليغرامات من الميثوكسي X04.

تحت غطاء الدخان ، قم بإذابة الميثوكسي X04 في 100 ميكرولتر من DMSO وحرك حتى يتم الحصول على محلول أخضر شفاف. أضف على التوالي 450 ميكرولتر من البروبيلين جلايكول و 450 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات أثناء التحريك. حافظ على خلط المحلول عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، يجب رؤية مستحلب أخضر مصفر. بعد حقن الميثوكسي X04 ، أضف جرعة 10 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم والتضحية بالحيوان في النقطة الزمنية المطلوبة وفقا للطرق المعتمدة ، اغسل الدماغ الثابت بالمالديهايد ثلاث مرات باستخدام PBS المبرد. بعد ذلك ، باستخدام شفرة حلاقة حادة ، قم بإزالة البصلة الشمية وقطع الدماغ إكليليا إلى قطعتين إلى ثلاث قطع متساوية الارتفاع تقريبا ، ويمكن تقسيمها جميعا في وقت واحد من أجل تسريع الإجراء.

ألصق قطع أنسجة المخ على لوحة العينة المثبتة في الدرج. تأكد من أن السطح المقطوع الأملس يلتصق بقوة بلوحة العينة. أضف محلول PBS إلى الدرج حتى يتم غمر سطح الدماغ بالكامل بالكامل.

ضع الدرج في الاهتزاز واضبط إعدادات الاهتزاز لإنتاج أقسام بسمك 50 ميكرون. ابدأ في القطع ، وإذا كان الفحص ، انقل الأقسام على الفور إلى PBS باستخدام فرشاة رسم دقيقة. بدلا من ذلك ، يمكن وضع الأقسام في قوارير زجاجية تحتوي على محلول محمي بالتبريد للتخزين عند 20 درجة مئوية.

بمساعدة أطلس دماغ الفأر التجسيمي ، حدد أقسام الدماغ التي تحتوي على منطقة الاهتمام وضع كل قسم في مادة التبريد في بئر من لوحة ثقافة مكونة من 24 بئرا. بعد ذلك ، استخدم ماصة يمكن التخلص منها لإضافة قطرة من PBS على شريحة مجهرية ثم ضع القسم على القطرة. افحص القسم تحت المجهر الفلوري لتحديد المناطق التي تحتوي على لويحات ميثوكسي X04 المسماة a-beta.

بدون تحريك مرحلة المجهر ، التقط صورا للمناطق ذات الأهمية في المجال الساطع وكذلك في وضع التألق. يجب أن تظهر كل صورة نفس المنطقة في كلا المجالين لربط اللويحة بالمنطقة الهيكلية لقسم الأنسجة. احفظ الصور الملتقطة وتسميتها وفقا لرقم.

قم أيضا بتسجيل رقم البئر في اللوحة وحقل الصور الملتقطة. ضع القسم مرة أخرى في البئر المخصص بمجرد اكتمال التصوير. افحص القسم التالي في التسلسل باستخدام نفس الإجراء لتجنب تجفيف الأقسام.

لمحاذاة الصور، افتح الحقل الساطع وصور مجال الأشعة فوق البنفسجية لنفس عائد الاستثمار في ImageJ. بعد ذلك ، استخدم المكون الإضافي MosaicJ لمحاذاة حواف الصورتين. احفظ الصورة المحاذاة والمدمجة وفقا لرقم البئر في مجلد برقم معين.

اجمع بين الصور من أقسام مختلفة من نفس لتحديد وتوطين اللويحات في المنطقة ذات الاهتمام. بعد اكتمال عملية الفحص ، قم بتخزين الأقسام التي تم فحصها عند 20 درجة مئوية عبارة عن صفيحة مزرعة مكونة من 24 بئرا تحتوي على مادة لاصقة بالتبريد حتى يتم إجراء تلطيخ مناعي أو مزيد من المعالجة. أولا ، قم بإعداد محلول رابع أكسيد الأوزميوم 1٪ في عازلة الفوسفات في قارورة زجاجية.

نظرا لأن رباعي أكسيد الأوزميوم حساس للضوء ، قم بتغطية القارورة الزجاجية بورق الألمنيوم لحماية المحلول من الضوء. بعد الغسيل في عازلة الفوسفات ، قم بإزالة المخزن المؤقت من الأقسام وانشرها بشكل مسطح باستخدام فرشاة رسم دقيقة. تأكد من تسطيح الأقسام مباشرة قبل إضافة رابع أكسيد الأوزميوم لأن أي طيات في الأقسام ستصبح دائمة ومحاولة تسطيح الأنسجة بعد تثبيت الأوزميوم لن تؤدي إلا إلى كسر الأقسام.

استخدم ماصة نقل لإضافة رابع أكسيد الأوزميوم إلى الأقسام قطرة واحدة في كل مرة حتى يتم غمر القسم. غطي البئر بورق الألمنيوم لحماية الأقسام من الضوء واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلال هذه الحضانة ، قم بإعداد الراتنج البلاستيكي في دورق يمكن التخلص منه.

امزج المكونات معا بالترتيب واخلطها جيدا باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر حتى يتم الحصول على لون موحد. انقل الخليط المحضر إلى أطباق الوزن المصنوعة من الألومنيوم. ستتلقى هذه أقسام الأنسجة بمجرد تجفيفها.

بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، قم بتجفيف الأقسام بتركيزات متزايدة من الإيثانول لمدة دقيقتين لكل منهما. انقل الأقسام المجففة من لوحة الثقافة المكونة من 24 بئرا إلى قوارير زجاجية سعة 20 مل. ثم اغمر الأقسام في أكسيد البروبيلين ثلاث مرات لمدة دقيقتين في كل مرة لإزالة الإيثانول المتبقي.

بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة زجاجية مثنية أو فرشاة رسم دقيقة لنقل الأقسام من محلول أكسيد البروبيلين إلى الراتنج البلاستيكي واتركها طوال الليل للتسلل في درجة حرارة الغرفة. بعد التسلل ، ضع أطباق الوزن المصنوعة من الألومنيوم التي تحتوي على العينات في فرن من 50 إلى 60 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. لتضمين أقسام على صفائح فيلم بولي كلورو ثلاثي فلورو إيثيلين ، استخدم أولا فرشاة رسم دقيقة لطلاء طبقة رقيقة من الراتنج على القسم.

بعد ذلك ، انقل قسما واحدا من الأنسجة في كل مرة من طبق وزن من الألومنيوم إلى لوح فيلم PCTFE. قم بإزالة الراتنج الزائد من حول الأنسجة ، مع الحرص على عدم إزعاجه. بعد نقل جميع الأقسام من طبق وزن واحد إلى لوح فيلم PCTFE ، ضع ورقة PCTFE ثانية فوق الأولى لإنشاء شطيرة من المناديل والراتنج بين الورقتين.

بلمرة الراتنج في حاضنة لمدة ثلاثة أيام عند 55 إلى 60 درجة مئوية. ثم تكون الأنسجة جاهزة للتقطيع الرقيق للغاية وفحص البنية الفوقية. تظهر الصور التالية تصويرا مزدوجا لقسم واحد من الحصين باستخدام أوضاع المجال الساطع والفلورة.

يتم تصور المناطق والطبقات ذات الأهمية تحت مجال ساطع. بينما يتم توطين لويحات a-beta بنجاح باستخدام مرشح الأشعة فوق البنفسجية في نطاق 340 إلى 380 نانومتر. تظهر هذه الصورة قسما من الحصين قبل التضمين المسبق للتلطيخ المناعي ل IBA1.

يتم تحديد لوحة مرئية بواسطة الخط المنقط. تظهر هذه الصورة نفس القسم بعد التضمين المسبق للتلطيخ المناعي ل IBA1 ومعالجة الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. لاحظ أن اللويحة المحاطة بخط منقط لا تزال مرئية عند معالجة الأنسجة للفحص المجهري الإلكتروني.

بمجرد إتقان هذا البروتوكول ، يمكن إكمال هذا البروتوكول في أسبوع واحد إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب القيام بكل خطوة بدقة لتقليل احتمالية التلوث والتدهور الهيكلي الآخر الذي سيؤثر على جودة العينات. لا تنس أن العمل باستخدام الأوزميوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذا يجب عليك دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

تأكد من التخلص منها بعد الاستخدام في نهاية تجربتك وفقا لإرشادات منشأتك.