الكشف عن القيامة في فيفو قبل بيوسينسور كاسباسيتراكير

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف وتتبع انعكاس عملية موت الخلايا بعد تنشيط الكاسباز في الحية باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء كنموذج. استجابة لمحفز الموت ، تخضع الخلايا لموت الخلايا المبرمج مثل موت الخلايا المبرمج الذي يعتبر تقليديا سلسلة لا رجعة فيها تؤدي إلى موت الخلايا. ومع ذلك ، من المثير للاهتمام ، أنه بعد إزالة محفز الموت ، يمكن لبعض الخلايا المحتضرة عكس عملية موت الخلايا حتى في المرحلة المتأخرة.

من خلال ظاهرة استعادة الخلايا المكتشفة حديثا والتي تسمى الاستحمام. يظهر الفحص المجهري للخلايا الحية أن الخلايا المحتضرة موت الخلايا المبرمج تظهر سمات مورفولوجية فريدة ، مثل فقاع غشاء البلازميد ، والتكثيف النووي ، وانكماش الخلية. بشكل عام ، من المتوقع أن تموت هذه الخلايا.

ومع ذلك ، بعد غسل الخلايا المحتضرة واحتضانها بوسط جديد ، فإنها تخضع للاستراحة ، وتتعافى ، ويمكن أن تنقسم لاحقا. من الصعب اكتشاف وتتبع الورم في الحية لأن الخلايا المستردة يمكن تمييزها شكليا عن الخلايا السليمة المحيطة. لحل هذه المشكلة ، تم تطوير نظام الاستشعار الحيوي CaspaseTracker للثدييات لتحديد وتتبع الخلايا التي تعكس عملية موت الخلايا بعد التنفيذ أو تنشيط الكاسباز ، وهي السمة المميزة لموت الخلايا المبرمج.

يتكون نظام الاستشعار الحيوي هذا من مكونين: منشط الكاسباز القابل للتنشيط ، rtTA ، ومراسل نشاط rtTA المستند إلى Cre LoxP. في الخلايا السليمة ، بدون نشاط كاسباز ، يتم ربط rtTA بمرساة غشاء البلازما من خلال رابط DEVD القابل للانقسام الكاسباز. نظرا لأن rtTA المربوط لا يمكنه الانتقال من العصارة الخلوية إلى النواة ، يظل مراسل rtTA غير نشط.

ومع ذلك ، عند التنشيط استجابة لتحريض موت الخلية ، تشق الكاسباسات رابط DEVD ، مما يحرر rtTA للانتقال إلى النواة لتنشيط مراسل rtTA. بمجرد دخوله إلى النواة ، يرتبط rtTA بعنصر استجابة tet ، أو TRE ، ويؤدي إلى التعبير العابر عن Cre recombinase ، مما يؤدي إلى حدث إعادة تركيب لا رجعة فيه يزيل كاسيت كودون التوقف بين محفز CAG وتسلسلات الترميز لبروتين الفلورسنت الأحمر DsRed. ينتج عن هذا التعبير الدائم عن DsRed الذي يعمل كعلامة فلورية دائمة للخلايا التي يمكن أن تظل على قيد الحياة بعد أن تعرضت لنشاط الكاسباز بالإضافة إلى ذريتها.

يظهر الفحص المجهري متحد البؤر للخلايا الحية أنه بعد تحريض موت الخلايا العابرة ، تعبر خلايا المستشعر الحيوي CaspaseTracker عن DsRed أثناء وبعد تعافيها ، وبالتالي ، تميزها عن الخلايا غير المستردة ، المشار إليها بالسهام البيضاء ، وكذلك خلايا الاستشعار الحيوي للتحكم التي لم تتعرض لتحفيز موت الخلية. يفترض عموما أن موت الخلايا المبرمج ، مثل موت الخلايا المبرمج ، لا رجعة فيه لأنه يتم تنفيذه عن طريق تدمير خلوي متفشي وهائل. ومع ذلك ، نجد أن تلك الخلية المحتضرة يمكن أن تتعافى بالفعل حتى في المرحلة المتأخرة التي تم اعتبارها نقطة اللاعودة ، مثل إطلاق السيتوكروم c ، وتنشيط caspase-3 ، وتلف الحمض النووي ، وفقاع غشاء البلازما ، وانكماش الخلية ، وتشكيل أجسام موت الخلايا المبرمج.

أطلقنا على هذا اسم انعكاس عملية موت الخلايا ، مما يعني الارتقاء إلى الحياة باللغة اليونانية. باستخدام الفحص المجهري للخلايا الحية ، يمكننا ملاحظة الاستراحة في الخلايا المستنبتة. ومع ذلك ، من الصعب تقنيا ملاحظة الورم في الحية لأن خلية الموت المستردة يمكن أن تبدو مثل الخلايا السليمة الطبيعية التي لم تحاول موت الخلايا على الإطلاق.

لذلك ، قمنا بتطوير نظام الاستشعار الحيوي CaspaseTracker لاكتشاف وتتبع الاستراحة في الحية. إصدار ذبابة الفاكهة من نظام CaspaseTracker عبارة عن مستشعر حيوي مزدوج يتكون من مكونين: عامل النسخ القابل للتنشيط في الكاسباز ، GAL4 ، ومراسل نشاط GAL4 ، المعروف باسم G-TRACE. في الخلايا التي لا تحتوي على نشاط كاسباز ، يتم ربط عامل نسخ الخميرة ، GAL4 ، بمجال مرساة غشاء البلازما من خلال رابط DQVD قابل للانقسام بالكاسباز.

عند تنشيط الكاسباز ، تشق الكاسبيسات المنشطة رابط DQVD لتحرير GAL4 ، والذي ينتقل بعد ذلك إلى النواة لتنشيط مراسل G-TRACE. يرتبط GAL4 النووي بتسلسلات تنشيط المنبع المحددة ، المختصرة UAS ، لتحفيز التعبير العابر عن RFP ، والذي يعمل كتقرير عن نشاط الكاسباز الحديث أو الحالي حتى يتوقف نشاط الكاسباز و GAL4 ويتحلل بروتين RFP. يؤدي GAL4 أيضا إلى التعبير عن إعادة تركيب FLP ، مما يؤدي إلى حدث إعادة تركيب يزيل كاسيت التوقف بين ubiquitin ، والاختصار Ubi ، والمروج ، وتسلسلات الطلاء ل GFP المستهدف نوويا.

ينتج عن هذا التعبير الدائم عن GFP النووي ، والذي يعمل كعلامة دائمة للخلايا التي عانت من نشاط الكاسباز ولكنها لا تزال على قيد الحياة بالإضافة إلى ذريتها. لذلك ، يمكن لهذا النظام تحديد الخلايا ذات نشاط الكاسباز المستمر أو الحديث عن طريق إشارة RFP العابرة ونشاط الكاسباز السابق مع إشارة GFP الدائمة. يحتوي المستشعر الحيوي للتحكم على طفرة DQVA في موقع انقسام الكاسباز ، وهو غير حساس لنشاط الكاسباز.

تم تهجين الذباب البكر GAL4 الحساسة لكاسباز مع الذباب الذكور الصغير G-TRACE ، أو العكس ، لتوليد ذباب CaspaseTracker. لاختبار قابلية انعكاس عملية موت الخلية بعد تنشيط الكاسباز ، يتعرض الذباب أولا للإجهاد البيئي العابر الذي يسبب موت الخلايا ، مثل الصدمة الباردة أو تجويع البروتين. ثم يتم نقل الذباب المجهد مرة أخرى إلى ظروف الاستزراع الطبيعية للتعافي.

تم الحصول على الأنسجة من غرف البيض في المبايض من الذباب الضابط أو المجهد أو المسترد. تم إخضاع العينات لفحص مجهري متحد البؤر للكشف عن إشارات الفلورسنت للمستشعر الحيوي CaspaseTracker. للبدء ، يطير DQVD GAL4 المخدر والمغلق مؤخرا الحساس للكاسباز باستخدام ثاني أكسيد الكربون ، وباستخدام فرشاة الرسم ، ينقل 7 إلى 10 إناث عذراء إلى قارورة طعام طازجة مع القليل من معجون الخميرة.

تزاوج الإناث مع 7 إلى 10 ذكور من الذكور المراسلين G-TRACE GAL4. يظهر الذباب البكر المغلق حديثا العقي الأخضر الداكن ، المشار إليه بالسهام ، وهي بقايا طعام اليرقات. يميل الذباب المغلق حديثا إلى أن يكون أكبر من الذباب الناضج.

الذكور لديهم بطن أغمق ، يشار إليه بالدوائر ، ويميلون إلى أن يكونوا أصغر من الإناث. قم بإعداد الصليب عند 18 درجة مئوية لتقليل الإشارات غير المحددة من المستشعر الحيوي CaspaseTracker في النسل لأن نشاط GAL4 يزداد مع درجة الحرارة. كل ثلاثة إلى سبعة أيام ، انقل البالغين إلى قارورة جديدة مع معجون الخميرة حتى تقل إنتاجيتهم.

عندما يتم إغلاق النسل ، قم بتوصيل الذباب بكل من الجينات المعدلة وراثيا من GAL4 و G-TRACE الحساسة للكاسباز ، والتي ستعمل كذباب ذرية CaspaseTracker. يتم موازنة كلا الإدخالين بواسطة Curly-O. لذا فإن الذباب المجنح غير المجعد سيكون له كلا الجينات المعدلة وراثيا.

للحصول على تحكم سلبي ، اجمع ذرية جينية معدلة وراثيا مزدوجة من تهجين بين إناث DQVA GAL4 غير الحساسة للكاسباز وذكور مراسل G-TRACE GAL4 أو العكس. من الصلبان التجريبية ، انقل مجموعات من 10 إلى 20 ذبابة أنثى مغلقة حديثا إلى قوارير جديدة مع معجون الخميرة. ستساعد إضافة بعض الذكور الإناث على إنتاج البيض.

انقل الذباب الذي يتغذى جيدا إلى 18 درجة مئوية لمدة يوم واحد حتى ينتج المبيضان غرف البويضات من خلال تكوين OO. ثم لحث غرف البيض على الخضوع لموت الخلايا المبرمج ، استخدم صدمة باردة. انقل الذباب إلى قارورة جديدة بدون طعام وقم بتجميدها على حرارة 7 درجات مئوية لمدة ساعة.

تتمثل إحدى الطرق البديلة للحث على موت الخلايا المبرمج في غرفة البيض في استخدام تجويع البروتين عن طريق وضع الذباب على 8 في المائة من السكروز ، و 1 في المائة من طعام أجار عند 18 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. قم بتغيير قوارير الطعام الخالية من البروتين يوميا عند استخدام هذه الطريقة. بعد الضغط على الذباب بأي من الطريقتين ، أعيدهم إلى حالة السكن الطبيعية والطعام بمعجون الخميرة لمدة ثلاثة أيام للسماح لهم بالتعافي.

في وقت لاحق ، قم بتشريح هذه الذباب لعزل غرف البويضات والمبايض. بعد تخديرها ، استخدم زوجين من الملقط لإزالة رؤوسهم. ثم اسحب الذباب عند قاعدة البطن لإزالة المبايض.

استعد لجمع المبايض عن طريق طلاء أطراف الماصة البلاستيكية ب 1 في المائة من BSA المذاب في الماء أو PBS حتى لا تلتصق غرف البيض بأطراف الماصة. بعد تشريح غرف البيض ، اجمعها في أطراف محضرة مع حوالي نصف مليلتر من PBS. ثم انقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة مليلتر واحد واترك البيض يستقر.

استمر في الإجراء في ظروف الإضاءة المنخفضة أو المظلمة تماما لمنع تبييض الصور لعلامات الفلورسنت. قم بالشفط من PBS وقم بتحميل 500 ميكرولتر من أربعة بالمائة بارافورمالدهايد في PBS في أنبوب الطرد المركزي. دع البيض يثبت لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع دوران لطيف.

تجنب التثبيت لفترات طويلة ، لأنه سيستنفد إشارة البروتينات الفلورية في غرف البيض. بمجرد الإصلاح ، قم بإزالة PFA وغسل غرف البيض ب 500 ميكرولتر من PBS-T ثلاث مرات. ثم احتضان غرف البيض باستخدام PBS-T طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع دوران لطيف لاختراق غرف البيض.

في صباح اليوم التالي ، أضف 500 ميكرولتر من PBS-T مع 5 ميكروغرامات من الصبغة النووية الزرقاء ، مثل Hoechst ، إلى غرف البيض. دعهم يحتضنون بدوران لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ساعتين ، ولكن ليس بعد الآن ، وإلا ستصبح الإشارات غير محددة. بعد ذلك ، اغسل حجرة البيض باستخدام PBS-T ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة.

بعد ذلك ، باستخدام ماصة دقيقة ، قم بشفط كل PBS-T وقم بتطبيق 200 ميكرولتر من عامل التركيب المضاد للتبييض. تطفو الأنسجة في الأعلى قبل أن تمتص عامل التثبيت بالكامل. احتضن حجرة البيض في العامل عند 4 درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات إلى ليلة كاملة.

بعد امتصاص عامل التثبيت بالكامل ، تغرق الأنسجة في قاع الأنابيب وتكون جاهزة للتركيب. للبدء ، ضع الفازلين على الشريحة الزجاجية أو زلة الغطاء لتجنب تدمير غرف البيض عن طريق الضغط الزائد. لتركيب غرف البيض الملون ، انقلها ب 200 ميكرولتر من عامل التركيب إلى شريحة زجاجية وقم بتغطيتها بقلة غطاء زجاجي 20 ملم مربع.

أغلق زلة الغطاء بطلاء الأظافر واستمر في استخدام الفحص المجهري متحد البؤر. في غرف بيض المبيض في ذباب CaspaseTracker السليم ، لم يكن هناك نشاط مستشعر حيوي ل CaspaseTracker ، يشار إليه من خلال نقص التألق الأخضر والأحمر. ومع ذلك ، بعد تعريض الذباب للإجهاد البيئي المسبب لموت الخلايا ، مثل تجويع البروتين لمدة ثلاثة أيام ، خضعت غرف البيض لعملية موت الخلايا مع تنشيط الكاسباز ، مما أدى إلى إشارات الاستشعار الحيوي RFP و GFP.

في المقابل ، ألغت طفرة موقع انقسام الكاسباز في ذباب DQVA غير الحساس للكاسباز حساسية المستشعر الحيوي ، مما يشير إلى أن إشارات المستشعر الحيوي تعتمد على نشاط الكاسباز. ثم تم إعطاء ذباب المستشعر الحيوي الجائع والحساس للكاسباز طعاما بروتينا لمدة ثلاثة أيام. لم تعبر غرف البيض في الذباب المستعاد عن مراسل الكاسباز العابر RFP ، مما يشير إلى عدم وجود نشاط كاسباز حديث أو مستمر.

الأهم من ذلك ، أن غرف البويضات المستردة عبرت فقط عن GFP ، مما يشير إلى أنها عكست عملية موت الخلايا بعد تنشيط الكاسباز. لوحظ التسم أيضا في الجسم الحي بعد إجهاد درجة الحرارة العابر الذي يسبب موت الخلية. استجابة للصدمة الباردة ، تعبر غرف البيض المحتضرة عن علامات المستشعر الحيوي RFP و GFP ، مما يشير إلى نشاط الكاسباز الحديث أو المستمر ، ممثلا بإشارة RFP ، ونشاط الكاسباز السابق ، الذي تمثله إشارة GFP.

ومع ذلك ، بعد تخفيف التوتر عن طريق العودة إلى حالة الزراعة الطبيعية لمدة ثلاثة أيام ، عرضت غرف البيض في الذباب المستعاد مراسل كاسباز GFP فقط ، مما يشير إلى أن الخلايا الموجودة في غرف البيض هذه خضعت للاستراحة في مرحلة ما بعد تنشيط الكاسباز. والجدير بالذكر أن إشارة GFP CaspaseTracker تكشف أن أنواعا متعددة من الخلايا داخل غرف البويضات قادرة على عكس عملية موت الخلايا وإصلاح الضرر الناجم عن الكاسباسات ، بما في ذلك خلايا الخط الجرثومي ، مثل البويضات والخلايا الممرضة ، وخلايا البصيلات الجسدية. ومن المثير للاهتمام ، أن GFP قام أيضا بتسمية الخلايا الموجودة في الجراثة ، والتي تحتوي على خلايا جذعية ، جنبا إلى جنب مع غرف البويضات المرتبطة بها في نفس سلسلة المبيض.

لذلك ، قد تكون غرف البويضات الإيجابية ل GFP مشتقة من الخلايا الجذعية التي خضعت للتحصن. فيما يلي صور توضح الأنسجة التي تعرض نشاط المستشعر الحيوي CaspaseTracker دون التعرض للإجهاد البيئي. هذه هي أجزاء الفم ، والأمعاء الأمامية ، والمحصول ، والأمعاء الوسطى ، والأمعاء الخلفية ، والأنابيب Malpighian ، وفتحة الشرج ، وقناة البيض ، والمبايض من ذبابة أنثى اليوم 0 تم تشريحها وإغلاقها حديثا.

يكشف الفحص المجهري متحد البؤر عن نشاط الكاسباز الأخير ، كما هو موضح في RFP ، ونشاط الكاسباز السابق ، المشار إليه بواسطة GFP. تظهر الصور المكبرة نشاط الكاسباز الأخير أو المستمر والسابق في الفص البصري ، والقلب ، والأنابيب المالبيجي ، والأمعاء الخلفية ، وجدران العضلات في غرف البيض التي شاركت في تحديد بقعة F-actin. تظهر بعض الأنسجة ، مثل قناة البيض ، نشاط الكاسباز السابق فقط.

تشير أنشطة المستشعرات الحيوية هذه إلى نشاط مخدر محتمل أثناء التطور الجنيني أو التوازن الطبيعي. يمكن أن يشير أيضا إلى نشاط الكاسباز غير المبرمج الحالي أو السابق. يرجى الاطلاع على المخطوطة لمزيد من التفاصيل.

يبلغ المستشعر الحيوي CaspaseTracker في الجسم الحي على وجه التحديد عن نشاط caspaseTracker غير الحساس مع التسلسل غير القابل للانقسام DQVA ليس له نشاط مستشعر حيوي. الإشارة الوحيدة هنا هي الإشارة غير المحددة للتألق التلقائي من الأصباغ والبشرة والأجسام الدهنية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم عام لكيفية استخدام نظام الاستشعار الحيوي CaspaseTracker لاكتشاف وتتبع الاستشعار في الحية.

يمكن لهذه المستشعرات الحيوية تسهيل دراسات العملة والوظيفة المعروفة للاستحمام. يحتوي تحديد مدى وصولهم على مجموعة واسعة من التطبيقات الفسيولوجية والمرضية والعلاجية. في حين أن هذه المستشعرات الحيوية يمكنها اكتشاف انعكاس موت الخلايا المبرمج بعد تنشيط الكاسباز ، إلا أنها يمكن أن تكتشف أيضا تعافي الخلايا بعد محاولتها أشكالا أخرى من موت الخلايا التي تنطوي بشكل مباشر أو غير مباشر على أنشطة الكاسباز.

عند تصميم تجربة ، من المهم جدا تضمين عناصر تحكم متبادلة لتمييز إشارة المستشعر الحيوي الفلوري التي تتعقب خلايا التخدير عن الخلايا المحتضرة ذات أنشطة الكاسباز المستمرة. الخلايا السليمة ذات أنشطة الكاسباز المبرمج المعروفة الحالية أو السابقة وإشارة التألق التلقائي غير المحددة من الصباغ والدهون والحرجة. يرجى الاطلاع على المناقشة التفصيلية في نسخة PDF من هذه المخطوطة.