تصور الكاسباز الالتهابي الناجم عن القرب في البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية
أبريل 6, 2022
يصف هذا البروتوكول سير العمل للحصول على البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية (MDM) من عينات الدم البشرية ، وهي طريقة بسيطة لإدخال مراسلي تكملة الفلور ثنائي الجزيئية (BiFC) بكفاءة إلى MDM البشري دون المساس بصلاحية الخلايا وسلوكها ، ونهج قائم على التصوير لقياس تنشيط كاسباز الالتهابي في الخلايا الحية.
هذا البروتوكول مهم لأنه يمكن استخدامه لتصور واستجواب مسار كاسباز الالتهابي على المستوى الجزيئي في الخلايا الحية في حالة مرضية معينة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لتحديد المكونات والمتطلبات وتوطين مجمعات تنشيط كاسباز الالتهابية في الخلايا المناعية الأولية. مع التحسينات الطفيفة ، يمكن تكييف هذه الطريقة مع الخلايا الأولية الأخرى ومجموعة من البروتينات التي يتم تنشيطها عن طريق قلة القلة ، ولا يقتصر تطبيقها على المنهجيات المجهرية.
أولا ، قم بشفط الوسائط من البلاعم المتمايزة تماما على أطباق 10 سم واغسل الطبقة الأحادية للخلية بوسط RPMI-1640 الدافئ الخالي من المصل ، وإزالة جميع الوسائط تماما. حصاد الخلايا عن طريق إضافة ملليلترين من محلول التربسين-EDTA الدافئ بنسبة 0.25٪ لكل طبق 10 سم. قم بسحب التربسين-EDTA بلطف لأعلى ولأسفل على الطبق بأكمله باستخدام ماصة دقيقة P-1000 ، ثم انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من وسط الثقافة الكاملة الدافئة.
تحقق من انفصال الخلايا تحت مجهر حقل ساطع وافصلها مرة أخرى إذا لزم الأمر. شفط الوسط وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من 1X PBS معقمة قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية. ثم خذ 20 ميكرولتر أليكوت لتحديد رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
خذ مرة إلى مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل عملية نقل وضعها في أنبوب 15 ملليلتر. أحضر إلى الحجم النهائي من 15 ملليلتر مع PBS المعقم 1X المسخن مسبقا. قم بشفط PBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة عند 250 × جم.
قم بإزالة أي PBS متبقية من حبيبة الخلية باستخدام ماصة دقيقة P-200. خذ أنبوب ميكروبوبي معقم سعة 1.5 ملليلتر لكل عملية نقل وأضف بلازميدات المراسل وبلازميدات BiFC المناسبة في غطاء المحرك. ضع محطة الماصة والجهاز والنصائح وأنابيب الكهربية والماصة في غطاء تدفق صفائحي معقم.
قم بتوصيل وتشغيل جهاز nucleofection. أدخل معلمات التحويل في شاشة بدء التشغيل المعروضة. اضغط على الجهد ، وأدخل 1000 ، واضغط على تم لضبطه على 1000 فولت.
اضغط على العرض، وأدخل 40، واضغط على تم لضبط النبض على 40 مللي ثانية. أخيرا ، اضغط على Pulses ، وأدخل 2 ، واضغط على Done لتعيين عدد النبضات الكهربائية إلى 2. خذ أحد أنابيب الكهربية واملأه بثلاثة ملليلتر من العازل الكهربائي E في درجة حرارة الغرفة.
أدخل أنبوب الكهربية في حامل الماصة في محطة الماصة، مما يضمن أن القطب الكهربائي الموجود على جانب الأنبوب مواجه للداخل ويسمع صوت نقرة عند إدخال الأنبوب. خذ حبيبة الخلية وأضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت R لإعادة التعليق المسخن مسبقا لكل واحد إلى مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة ، واخلطها بلطف مع ماصة دقيقة P-20. أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل أنبوب نقل واخلطها بلطف مع ماصة دقيقة P-20.
أدخل طرفا في الماصة عن طريق الضغط على زر الضغط على المحطة الثانية ، مما يضمن أن المشبك يلتقط تماما جذع المكبس المتصاعد في الطرف. بعد ذلك ، اضغط على زر الضغط الموجود على الماصة إلى المحطة الأولى واغمس في الأنبوب الأول الذي يحتوي على خليط الحمض النووي للخلية أو البلازميد لشفط العينة. أدخل الماصة مع العينة بعناية فائقة في حامل الماصة، مما يضمن نقر الماصة ووضعها بشكل مناسب.
اضغط على زر البدء على الشاشة التي تعمل باللمس وانتظر حتى يتم تسليم النبضات الكهربائية. قم بإزالة الماصة ببطء من المحطة وأضف على الفور تعليق الخلية المنقول إلى البئر المقابل مع الوسط الخالي من المضادات الحيوية الذي تم تسخينه مسبقا عن طريق الضغط ببطء على زر الضغط على المحطة الأولى. هز الصفيحة بلطف بخلايا معبرة واحتضنها لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة ، ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط الثقافة المسخن مسبقا إلى كل بئر.
ضع الطبق في الحاضنة واسمح ب 24 ساعة على الأقل للتعبير الجيني. في اليوم التالي ، افحص صلاحية الخلية وكفاءة النقل باستخدام مجهر epifluorescence. قم بإزالة الوسائط من الخلايا بعناية باستخدام ماصة دقيقة P-1000 وأضف 500 ميكرولتر من محلول التحفيز أسفل جانب البئر.
لتشغيل آبار التحكم غير المعالجة ، أضف وسيطا للتصوير بدون الحافز. لتصور الخلايا باستخدام مجهر epifluorescence أو مجهر بؤري ، قم بتشغيل المجهر ومصدر الضوء الفلوري باتباع التعليمات. حدد الهدف 10 مرات أو 20 مرة وضع طبق الثقافة على مسرح المجهر.
ابحث عن الخلايا الموجودة تحت مرشح 568 نانومتر باستخدام قطعة العين. والتركيز على الخلايا المعبرة عن الخلايا الحمراء للمراسل. عد جميع الخلايا الحمراء في المجال البصري.
أثناء وجودك في نفس المجال المرئي ، قم بالتغيير إلى مرشحات 488 أو 512 ، قم بحساب عدد الخلايا الحمراء الخضراء أيضا. احسب ما لا يقل عن 100 خلية حمراء من ثلاثة حقول على الأقل. احسب النسبة المئوية للخلايا المنقولة إيجابية الزهرة لكل مجال بصري ومتوسط النسب المئوية الناتجة لكل علاج بشكل جيد للحصول على الانحراف المعياري.
لتصوير الخلايا باستخدام مجهر epifluorescence أو مجهر بؤري ، تصور الصورة الحية للخلايا على شاشة الكمبيوتر كما حصلت عليها الكاميرا. قم بضبط التركيز البؤري وموضع الخلايا باستخدام عجلة التحكم في عصا التحكم والتركيز. اضبط النسبة المئوية لطاقة الليزر ووقت التعرض لليزر 512 نانومتر أو 488 نانومتر و568 نانومتر ، بحيث تبدو الإشارة في الصورة جيدة دون تشبع.
قم بتشغيل الالتقاط المباشر وفحص الصورة الناتجة، مما يضمن رؤية ذروة مميزة لكل طابق في الرسم البياني للشاشة لكلتا القناتين. أثناء تصور الصورة الحية للخلايا، التقط صورا تمثيلية متعددة لحقل يحتوي على خلية واحدة أو أكثر تعبر عن مراسل mCherry أو dsRedmito لكل بئر من اللوحة. أظهرت الخلايا الوحيدة الإيجابية المختارة CD-14 المحتضنة مع GM-CSF لمدة سبعة أيام تغيرات في مورفولوجيا الخلية على مدار فترة التمايز ، حيث انتقلت من خلايا التعليق الكروية إلى المغزل والمرتبطة بالكامل ، وأخيرا ، إلى خلايا أكثر انتشارا عند تمييزها بالكامل.
تم نقل الخلايا المتمايزة بالكامل مع أزواج كاسباز BiFC VC و VN جنبا إلى جنب مع المراسل البلازميد dsRedmito ، والذي تم استخدامه لتسمية الخلايا العابرة. لم تظهر الخلايا غير المعالجة أي تألق فينوس. وفي الخلايا المعالجة بالنيجريسين ، ظهر caspase-1 BiFC كثقب واحد مع الشكل النموذجي لبقع ASC.
أظهر القياس الكمي ل MDM الإيجابي لكوكب الزهرة أن أعلى نسبة مئوية من caspase-1 BiFC شوهدت في مجموعة علاج LPS بالإضافة إلى nigericin. في المعايرة بالتحليل الحجمي للكاسباز-1 و 4 و 5 أزواج مؤيدة ل BiFC ، نتجت أعلى نسبة من الخلايا الإيجابية لكوكب الزهرة عن 400 و 500 و 1000 نانوغرام من البلازميد العابر ، على التوالي. أظهرت الصور البؤرية التي تم الحصول عليها بهدف 20 مرة لحقل من الخلايا بعد 24 ساعة من التحويل أن الخلايا العابرة غير المعالجة قابلة للحياة لأن الميتوكوندريا سليمة.
بعد العلاج بالهيم ، يظهر مركب caspase-1 كثقب أخضر واحد مشابه لتلك التي يسببها nigericin. تذكر تجنب الظروف القاسية والتلاعب المفرط بالخلايا أثناء التمايز والنقل والعلاج لأنه يمكن أن يؤدي إلى تنشيط تلقائي ومستويات خلفية عالية من تنشيط كاسباز.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يصف هذا البروتوكول طريقة للحصول على البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة (MDM) من عينات الدم البشرية وإدخال مراصد التكامل الفلوري الثنائي للكاسبيز الالتهابي (BiFC) في هذه الخلايا. كما يحدد أيضًا نهجًا قائمًا على التصوير لقياس تنشيط الكاسبيز الالتهابي في الخلايا الحية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- علم المناعة
- مجهر الفلورة
الخلفية
- تلعب الكاسبيز الالتهابية دورًا حاسمًا في الاستجابات المناعية.
- فهم تنشيطها ضروري لدراسة الأمراض المختلفة.
- يتيح هذا البروتوكول تصور مسارات الكاسبيز في الخلايا الحية.
- يمكن تكييفه لخلايا أولية وبروتينات أخرى تنشط عن طريق التجميع.
هدف الدراسة
- تصور واستجواب مسار الكاسبيز الالتهابي على المستوى الجزيئي.
- تحديد مكونات وتوضع معقدات تنشيط الكاسبيز الالتهابي.
- توفير طريقة قابلة للتطبيق على مختلف الخلايا المناعية الأولية.
الطرق المستخدمة
- استخلاص الوسط من البلاعم المتمايزة وغسلها بـ RPMI-1640 خالٍ من المصل.
- حصاد الخلايا باستخدام محلول trypsin-EDTA.
- نقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي مع وسط زراعة كامل.
- إدخال مراصد BiFC لمراقبة تنشيط الكاسبيز.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في إدخال مراصد BiFC دون المساس بحيوية الخلايا.
- يمكن قياس تنشيط الكاسبيز الالتهابي في الخلايا الحية.
- يمكن تحديد مكونات معقدات التنشيط.
- التقنية قابلة للتكيف مع الخلايا الأولية الأخرى والبروتينات.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة لدراسة الكاسبيز الالتهابية في الخلايا المناعية.
- يعزز الفهم للاستجابات المناعية في حالات مرضية مختلفة.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى ما هو أبعد من التصوير إلى منهجيات أخرى.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of inflammatory caspase activation complexes in primary human immune cells, providing a live-cell readout for target validation in inflammasome-driven diseases. By measuring proximity-induced dimerization as a proxy for caspase activation, it supports mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting IL-1β and IL-18 pathways. The approach offers predictive confidence in early discovery by linking molecular engagement to functional outcomes in disease-relevant human monocyte-derived macrophages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by visualizing caspase-1, -4, or -5 prodomain recruitment to inflammasomes as a measure of target engagement.
- Operational Value: Enables pathway clarification through live-cell imaging of activation complex localization and dynamics in primary human macrophages.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating compound-induced changes in Venus-positive puncta with downstream cytokine maturation and pyroptosis.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing a reproducible fluorescence-based readout of caspase activation in nucleofected MDM.
- Quantitative Output: Generates percentage of Venus-positive cells as a scalable, imaging-compatible metric for compound screening and dose-response analysis.
- Platform Reuse: Adaptable to other primary cells and oligomerization-activated proteins, enabling cross-target application in inflammation and immunology programs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses primary human monocyte-derived macrophages to model inflammatory signaling cascades relevant to autoimmune and infectious disease pathophysiology.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by monitoring activation complexes in living cells under near-physiological conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying activation thresholds and localization patterns that correlate with functional inflammasome output.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement screening to mechanistic validation, enabling iterative design of inflammasome modulators using human primary cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing caspase activation complexes in response to stimuli like LPS/nigericin or heme, clarifying pathway requirements in human MDM.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative fluorescence outputs that allow comparison of test compounds across treatment conditions in a standardized format.
- Analytics: Provides statistical readouts (percentage Venus-positive cells, standard deviation) that enable comparison of activation levels and compound potency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using disease-relevant human cells to model inflammasome activation seen in patient samples.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform for oligomerization-dependent targets beyond caspases, supporting broad application in immunology and inflammation portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct visualization of activation complexes.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via nucleofection-based delivery and quantitative imaging protocols in primary human cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking molecular proximity to functional inflammasome activity, reducing late-stage biological risk in cytokine-targeted programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their ability to modulate caspase activation in disease-relevant human immune cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell culture, nucleofection, and fluorescence microscopy for successful reporter delivery and activation monitoring.
- Depends on access to nucleofection equipment, confocal or epifluorescence microscopy, and image analysis tools for quantifying Venus-positive cells.
- Necessitates cross-team standardization of transfection parameters, stimulus conditions, and imaging settings to ensure reproducibility across laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending the BiFC approach to other primary cell types or oligomerization-sensitive proteins, including optimization of plasmid ratios and expression timing.
- Includes practical limitations such as the need for careful controls to avoid spontaneous activation and background fluorescence that could compromise signal-to-noise ratio.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Preparation of Cells for Electroporation
2:11
Nucleofection of Caspase BiFC Components into Human Monocyte-Derived Macrophages
4:41
Treatment of Transfected MDM and Caspase BiFC Data Acquisition
6:37
Results: Differentiation of CD14-Monocytes and Transfection of Human Monocyte-Derived Macrophages
8:12
Conclusion
