تضيء سبل تفعيل Caspase استخدام التكامل Bimolecular Fluorescence

العام لهذه المنهجية هو تصور إحدى الخطوات الأولى في تنشيط الكاسباسات البادئة. تسمى هذه الخطوة القرب المستحث وتحدث عندما تجتمع جزيئات الكاسباز معا لتشكيل ثنائيات نشطة أثناء موت الخلايا المبرمجة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حقل caspase مثل متى وأين وكيف يمكن تنشيط caspases البادئ المحدد بكفاءة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمرء أن يتصور تجميع مجمعات تنشيط الكاسباز في الخلايا الحية في الوقت الفعلي. تستخدم طريقة تكميل التألق الجزيئي الحيوي هذه شظايا من بروتين هرمون الغدة الدرقية ، كوكب الزهرة ، التي تم غرسها في الكاسباز. الشظايا ليست فلورية من تلقاء نفسها ولكن عندما يخضع الكاسباز للقرب المستحث ، فإن هذا يجمع نصفي كوكب الزهرة معا ويضيءان.

لنقل الخلايا ، أضف أولا 12 ميكرولترا من كاشف التعدي إلى 750 ميكرولترا من وسائط المصل المخفضة في أنبوب معقم. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم أضف 10 نانوغرام من بلازميد مراسل إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مليلتر لكل بئر يتم نقله.

أضف 20 نانوغراما من كل بلازما كاسباسي BiFC إلى كل أنبوب. ارفع حجم كل أنبوب إلى 100 ميكرولتر عن طريق إضافة وسائط مصل مخفضة. باستخدام ماصة P200، أضف 100 ميكرولتر من محلول كاشف النفش إلى خليط البلازميد بطريقة متساقطة.

بعد احتضان مزيج كاشف تعداء البلازميد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بشفط الوسط من الخلايا باستخدام ماصة أو بالشفط. ثم باستخدام ماصة P1000، قم بتمرير 800 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل برفق أسفل جانب البئر. باستخدام ماصة P200 ، أضف 200 ميكرولتر من مركب دهون الحمض النووي بالتنقيط إلى كل بئر.

احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسائط الخالية من المصل التي تحتوي على مجمعات دهون الحمض النووي عن طريق الشفط باستخدام الشفط أو باستخدام الماصة مع الحرص على عدم تعطيل الطبقة الأحادية. الماصة ملليلترين من وسائط النمو الكامل الدافئة مسبقا برفق أسفل جانب كل بئر قبل احتضان الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص.

قبل الحصول على البيانات ، قم بإجراء تحريض تنشيط الكاسباز كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتشغيل المجهر باتباع تعليمات التصنيع وقم بتشغيل برنامج الاستحواذ. حدد هدف الزيت 60x أو 63x وضع قطرة من الزيت على الهدف.

ثم ضع طبق الثقافة على مرحلة المجهر باستخدام حامل اللوحة الصحيح. قم بتشغيل المدفأة واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. ركز على مضان المراسل باستخدام ليزر أو مرشح RFP.

أدخل النسبة المئوية لطاقة الليزر عند 50٪ ووقت التعرض عند 100 مللي ثانية لكل من كوكب الزهرة وRFP كنقطة انطلاق لتحديد الإعدادات المثلى لاستخدامها في التجربة. قم بتشغيل الالتقاط المباشر وافحص الصورة الناتجة والرسوم البيانية المعروضة لكلتا القناتين. إذا كانت الإشارة منخفضة وكان من الصعب تحديد الصورة ، فقم بزيادة النسبة المئوية لطاقة الليزر و / أو وقت التعرض بزيادات حتى تبدو الإشارة والصورة جيدة.

بعد ذلك ، حدد أو افتح وحدة Z stack في برنامج المجهر. اضبط التركيز في اتجاه واحد حتى لا تصبح الخلية مرئية. حدد هذا كموضع علوي.

اضبط التركيز في الاتجاه المعاكس حتى تختفي الخلية مرة أخرى وحدد هذا كموضع السفلي. اختر حجم الخطوة الأمثل وابدأ عملية الاستحواذ. إذا لزم الأمر ، اضبط الرسم البياني للشاشة لتحسين المظهر المرئي لإشارة الفلورسنت.

أخيرا ، استخدم برنامج عرض ثلاثي الأبعاد لإعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد. في حالة توفر مصدر لثاني أكسيد الكربون ، ضع جهاز توصيل ثاني أكسيد الكربون أعلى حامل اللوحة. اضبط مستوى ثاني أكسيد الكربون على 5٪ وقم بتشغيل وحدة التحكم في ثاني أكسيد الكربون من داخل البرنامج.

انتقل إلى حقل من الخلايا المنقولة. تصور الصورة الحية للخلايا كما حصلت عليها الكاميرا وعرضها برنامج الاستحواذ على شاشة الكمبيوتر باستخدام ليزر RFP. بعد ذلك ، أدخل إعدادات النسبة المئوية لطاقة الليزر ووقت التعرض لليزر RFP.

بعد ذلك ، أدخل الإعداد للنسبة المئوية لطاقة الليزر ووقت التعرض لضوء الليزر YFP. لكل بئر من اللوحة ، اختر عددا من المواضع المختلفة التي تحتوي على خلية واحدة أو أكثر تعبر عن المراسل. أدخل الفاصل الزمني بين كل إطار من الدورات الزمنية وإجمالي عدد الإطارات التي سيتم اتخاذها.

أعد النظر في كل موضع وقم بتصحيح التركيز وتحديثه حسب الحاجة. ابدأ الفاصل الزمني واحفظ البيانات. أخيرا ، قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج التصوير المتاح كما هو موضح في بروتوكول النص.

يظهر هنا مثال على caspase-2 BiFC بعد تلف الحمض النووي. عولجت الخلايا بمثبط توبويزوميراز واحد: كامبتوثيسين. تم استخدام بروتين الفلورسنت الأحمر ، mCherry ، كمراسل لإظهار أن الخلايا تعبر عن مسبار BiFC وتساعد في تصور العدد الإجمالي للخلايا.

يظهر تألق كوكب الزهرة باللون الأخضر وتمثل النقطة الكبيرة القرب الناجم عن كاسباز -2. لتوفير تصور عالي الدقة للتوطين تحت الخلوي لمركب تنشيط الكاسباز ، يمكن تصوير الخلايا المفردة في ثلاثة أبعاد. يظهر تنشيط Caspase-2 هنا باللون الأخضر وتظهر النواة باللون الأحمر.

يتم عرض عرض الشرائح المتعامدة للخلية حيث يمكن تصور المستوى xy والمستوى yz ومستوى xz جنبا إلى جنب. يمكن أيضا عرض الصورة ثلاثية الأبعاد في فيلم حيث يتم تدوير الخلية حول المحور y. لتوفير البيانات الحركية لتصوير الفاصل الزمني من كاسباز ، يمكن استخدام التصوير بفاصل زمني.

يظهر هذا الفيلم تنشيط كاسباز 2 باللون الأخضر بعد العلاج بمثبط البروتيازوم: بورتيزوميب. تظهر الميتوكوندريا باللون الأحمر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام Caspase BiFC لتتبع تجميع مجمعات تنشيط الكاسباز في الوقت الفعلي ولتحديد حجم المجمعات التي تم إنتاجها وشكلها وتوطينها بوضوح.

يحدد هذا البروتوكول بعض الأساليب القائمة على المجهر لجمع النتائج لتجربة Caspase BiFC. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن استخدام عدد من الاختلافات والمجموعات من هذه الأساليب لاستجواب مسارات تنشيط Caspase بشكل إبداعي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تضمين عناصر التحكم من القطع الأثرية المستحثة بالفحص المجهري مثل سمية الصورة وتبييض الصور. يتضمن بروتوكول النص المصاحب نصائح لتحقيق ذلك.

تحديد طريقة الاستحواذ والتحليل التي يجب استخدامها من خلال المحيط المراد استكشافه وتوافر الأجهزة وبرامج التصوير. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام مناهج تحليل التصوير لتفسير البيانات. يمكنك قياس التغيرات في شدة التألق بمرور الوقت أو النسبة المئوية لخلايا الفلورسنت.

يمكن أيضا حساب عدد البؤر أو حجم الكائن.