المراقبة والكمي لالتيلومير وتسلسل المتكررة عن طريق الإسفار

الهدف العام من تقنية التهجين الموضعي المتألق هذه هو تحليل عدد وأطوال التيلوميرات في ديدان C.Elegans بشكل موجز. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول تجدد الأورام، والاستطالة البديلة للتيلوميرات، والشيخوخة الخلوية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن إجراءاتها موجزة، كما يمكن تصور التيلوميرات وقياسها كمياً في أقل من 24 ساعة.

اجمع الديدان البالغة الحاملة مع كمية قليلة من الوسط السائل الخالي من الشوائب في أنبوب سعة 15 milliliter. الآن اغسل الديدان ثلاث مرات كما يلي: أضف M9 buffer ليصل الحجم الإجمالي إلى 15 milliliters.

بعد ذلك، قم بطرد الأنبوب مركزياً بسرعة 300 G لمدة ثلاث دقائق، وتخلص من المحلول الموجود فوق كتلة الديدان. ثم كرر العملية. إذا كانت الديدان تطفو بعد عملية الطرد المركزي، فقم بتخفيف قوة الكبح في جهاز الطرد المركزي.

بعد الغسلة الثالثة، اترك الديدان مع 5 milliliters من M9. ثم أضف 6.5 milliliters من الماء المقطر، وtwo milliliters من الهايبركلوريت، وone milliliter من هيدروكسيد البوتاسيوم بتركيز five molar. اترك الديدان تحضن في محلول التبييض هذا لمدة ثلاث دقائق مع التقليب بسرعة 50 RPM. بعد ذلك، استخدم جهاز الفورتيكس (vortex) لتمزيق الديدان وفتحها لتحرير بيوضها.

ابحث عن البيوض المتحررة باستخدام مجهر التشريح. إذا لم تتحرر البيوض بعد، استمر في عملية الحضنة لمدة تصل إلى ثماني دقائق. وإذا تحللت الديدان في الغالب وأصبحت البيوض حرة، املأ الأنبوب بمحلول M9 حتى 15 milliliters واغسل البيوض ثلاث مرات تماماً كما تم غسل الديدان سابقاً.

إلى البيوض المغسولة، بعد إزالة معظم وسط M9، أكمل الحجم إلى 500 microliters باستخدام PBST، ثم أضف 500 microliters من 4%PFA. الآن، قم بتحميل حصص مقدارها 40 microliter من البيوض الموجودة في 2%PFA في آبار شرائح مطلية بالبولي ليسين. بعد ذلك، انقل الشرائح إلى غرفة رطبة واتركها لتحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بالنسبة لهذا البروتوكول، يجب توفير كتلة من الألومنيوم على ثلج جاف محفوظة عند 80 درجة مئوية. كما يجب توفير الميثانول والأسيتون محفوظة عند 20 درجة مئوية. بعد اكتمال خطوة التثبيت، قم بإزالة معظم محلول PFA من الشرائح، مع ترك حوالي 5 µL.

بعد ذلك، ضع شرائح ثانية مغطاة بالبولي ليسين فوق كل شريحة عينة بحيث تلتصق السطحان المغطيان معاً، مما يؤدي إلى حبس الأنسجة داخل البئر. وفي حال وجود فائض من المثبت، قم بامتصاصه باستخدام منديل ورقي. الآن، قم بتجميد الشرائح بوضعها على كتلة ألومنيوم باردة لمدة 15 دقيقة على الأقل.

في هذه الأثناء، قم بتحضير حمامات من الميثانول والأسيتون على الثلج من أجل الشرائح. بمجرد تجمد الشرائح، قم بتدوير إحداها لكسر العينة بالتجميد. تخلص من الشريحة العلوية وانقع الشريحة السفلية في ميثانول بارد جداً لمدة خمس دقائق.

كرر هذه العملية لجميع العينات. يسمح التكسير بالتجميد بنفاذ المجسات والأجسام المضادة عبر قشرة البيضة الصلبة. إذا تم تكسير البيض بالتجميد بنجاح، ستتمكن من رؤية البيض على كلا الشريحتين.

بعد مرور خمس دقائق على الأقل في الميثانول، انقل الشرائح إلى الأسيتون البارد لمدة خمس دقائق. وفي غضون خمس دقائق أخرى، انقع العينات في PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل حمام. بعد غسلات PBST، يمكن تخزين الشرائح في ethanol بتركيز 100% عند درجة حرارة 4 °C لعدة أيام.

للمتابعة، أضف 20 µL من محلول RNase إلى آبار العينات واتركها في غرفة رطبة عند 37 °C لمدة ساعة. بعد ذلك، اغسل الشرائح في محلول 2x SSCT مرتين لمدة 15 دقيقة لكل غسلة. وبعد الغسلتين، أضف 20 µL من محلول التهجين إلى العينات واتركها في غرفة رطبة عند 37 °C لمدة ساعة.

وفي هذه الأثناء، قم بتجهيز المسبار الخاص بـ DNA مزدوج السلاسل. قم بمسخ المسبار عند 95 درجة Celsius لمدة خمس دقائق، ثم برده سريعاً على الثلج. بعد مرور ساعة، قم بشفط محلول التهجين وأضف محلول المسبار.

من هذه الخطوة فصاعداً، يجب حماية العينة من الضوء. بعد إضافة المسبار، قم بتغطية العينات بصفائح غطاء زجاجية. ثم قم بإنشاء غرفة ترطيب على كتلة تسخين بدرجة حرارة 80 degrees Celsius.

عندما يستقر القالب الحراري ويعود إلى 80 درجة Celsius، ضع شرائح العينات في الغرفة المسخنة واتركها لتتم عملية المسخ لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، قم بتحضين جميع الشرائح المعالجة في غرفة رطبة عند 37 درجة Celsius طوال الليل. وبعد التحضين الليلي، اغسل العينات في PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

كجزء من التحضير، قم بتدفئة محلول التهجين إلى 37 درجة مئوية قبل ساعة واحدة من عملية الغسل. بعد ذلك، ضع الشرائح في وعاء يحتوي على محلول غسل التهجين واتركها في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ولإزالة محلول التهجين، اغسل العينات باستخدام PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

كرر هذه العملية ثلاث مرات. بعد سحب غسول PBST الأخير، أضف 20 microliters من محلول الحجب إلى كل عينة، ثم حضنها في غرف رطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد ذلك، اسحب محلول الحجب واستبدله بمحلول الجسم المضاد لـ anti-digoxigenin المقترن بـ FITC بتخفيف 1 إلى 200.

قم بتغطية الشرائح وتحضينها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات في الظلام. بعد صبغ الأجسام المضادة، اغسل العينات مرتين باستخدام PBST لمدة 15 دقيقة لكل غسلة في الظلام. بعد ذلك، اسحب PBST واستبدله بـ 10 µL من محلول التثبيت الذي يحتوي على DAPI.

ضع شريحة غطاء وقم بامتصاص أي محلول زائد. وأخيراً، قم بإغلاق حواف شريحة الغطاء بطلاء الأظافر ثم ابدأ بفحص العينات تحت مجهر فلوري. وباستخدام مسبار PNA، تمت ملاحظة التيلوميرات في الحيوانات التي نجت من طفرة كافية التيلومير.

في الغدد التناسلية، يمكن قياس عدد التيلوميرات في كل نواة. وقد تزامنت إشارة التيلومير مع إشارة TALT1 في الموقع ذاته، مما يدعم الفكرة القائلة بأن TALT1 مسؤول عن البقاء على قيد الحياة في غياب التيلوميرات. وتمت مقارنة شدة إشارة التيلومير باستخدام برنامج حاسوبي.

كانت الإشارة أقوى في الناجين من مسار ALT مقارنة بالسلالات الأبوية التي استُخدمت لإنتاج الطفرات الناقصة في التيلوميرات. لا تنسَ أن العمل باستخدام البارافورمالدهيد والفورماميد يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء القفازات، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.