المراقبة والكمي لالتيلومير وتسلسل المتكررة عن طريق الإسفار في الموقع التهجين (FISH) مع السلطة الوطنية الفلسطينية تحقيقات في انواع معينة ايليجانس

الهدف العام من تقنية التهجين الفلوري في الموقع هو تحليل عدد التيلومير وطوله بإيجاز في C.Elegans. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول إعادة تكوين الورم ، والإطالة البديلة للتيلوميرات ، والشيخوخة الخلوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الإجراءات موجزة ويمكن تصور التيلوميرات وقياسها كميا في أقل من 24 ساعة.

اجمع الديدان البالغة الحاملة بقليل من الوسائط السائلة بدون حطام في أنبوب سعة 15 مل. الآن اغسل الديدان ثلاث مرات على النحو التالي. أضف المخزن المؤقت M9 لحجم إجمالي يبلغ 15 ملليلترا.

ثم قم بتدوير الأنبوب لأسفل عند 300 جم لمدة ثلاث دقائق ، وتخلص من المحلول فوق حبيبات الديدان. ثم كرر العملية. إذا كانت الديدان تطفو بعد الطرد المركزي ، فقم بتفتيح الفرامل على جهاز الطرد المركزي.

بعد الغسيل الثالث ، اترك الديدان مع 5 مل من M9. ثم أضف 6.5 مل من الماء المقطر ، ومليلترين من هايبركلوريت ، ومليلتر واحد من خمسة مولي هيدروكسيد البوتاسيوم. دع الديدان تحتضن في محلول التبييض هذا لمدة ثلاث دقائق مع 50 دورة في الدقيقة من التحريض. ثم قم بتدوير الديدان لقصها وفتحها وتحرير بيضها.

تحت مجهر التشريح ، ابحث عن البيض الذي تم إطلاقه. إذا لم يتم إطلاق سراحهم بعد ، فاستمر في الحضانة أو حتى ثماني دقائق. إذا تم إذابة الديدان في الغالب وكان البيض مجانيا ، فاملأ الأنبوب حتى 15 مل ب M9 واغسل البيض ثلاث مرات تماما كما تم غسل الديدان من قبل.

إلى البيض المغسول ، مع إزالة معظم M9 ، املأ الحجم إلى 500 ميكرولتر باستخدام PBST ، ثم أضف 500 ميكرولتر من 4٪ PFA. الآن قم بتحميل 40 ميكرولتر من البيض في 2٪ PFA إلى آبار الشرائح المطلية بالبولي لايسين. ثم انقل الشرائح إلى غرفة رطبة واتركها تحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بتخزين كتلة من الألومنيوم على الثلج الجاف عند 80 درجة مئوية. أيضا ، قم بتخزين الميثانول والأسيتون عند 20 درجة مئوية. بعد اكتمال خطوة التثبيت ، قم بإزالة معظم محلول PFA من الشرائح ، مع ترك حوالي خمسة ميكرولترات.

ثم ضع شرائح ثانية مطلية بالبولي ليسين فوق كل شريحة عينة بحيث يلتصق السطحان المطليان ببعضهما البعض ، مما يؤدي إلى حبس الأنسجة في البئر. إذا كان هناك مثبت مفرط ، فقم بمسحه بمنديل. الآن قم بتجميد الشرائح عن طريق وضعها على كتلة الألمنيوم الباردة لمدة 15 دقيقة على الأقل.

في هذه الأثناء ، قم بإعداد حمامات الميثانول والأسيتون على الجليد للشرائح. بمجرد تجميد الشرائح ، قم بلف واحدة لتجميد العينة. تخلص من الشريحة العلوية وانقع الشريحة السفلية في الميثانول المثلج لمدة خمس دقائق.

افعل هذا لجميع العينات. يسمح التكسير بالتجميد باختراق المجسات والأجسام المضادة من خلال قشر البيض الصلب. إذا تم تجميد البيض بنجاح ، يمكنك رؤية البيض على كلتا الشريحتين.

بعد خمس دقائق على الأقل من الميثانول ، انقل الشرائح إلى الأسيتون البارد لمدة خمس دقائق. في غضون خمس دقائق أخرى ، انقع العينات في PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل حمام. بعد غسل PBST ، يمكن تخزين الشرائح في 100٪ من الإيثانول عند أربع درجات مئوية لعدة أيام.

للمضي قدما ، أضف 20 ميكرولترا من محلول RNase إلى آبار العينة واحتضانها في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح في 2x SSCT مرتين لمدة 15 دقيقة لكل غسلة. بعد الغسلتين ، أضف 20 ميكرولترا من محلول التهجين إلى العينات واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة في غرفة رطبة.

في هذه الأثناء ، قم بإعداد المسبار لمسبار الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل. قم بتغيير طبيعته عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم قم بتبريده على الجليد لفترة وجيزة. بعد ساعة ، قم بشفط محلول التهجين وأضف محلول المسبار.

من هذه الخطوة إلى الأمام ، قم بحماية العينة من الضوء. بعد إضافة المسبار ، قم بتغطية العينات بزلات غطاء زجاجي. ثم اصنع غرفة رطبة على كتلة حرارية 80 درجة مئوية.

عندما تستقر كتلة الحرارة مرة أخرى إلى 80 درجة مئوية ، ضع شرائح العينة في الغرفة الدافئة واتركها تشوه لمدة ثلاث دقائق. ثم احتضان جميع الشرائح المعالجة في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية طوال الليل. بعد الحضانة الليلية ، اغسل العينات في PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

أثناء التحضير ، قم بتسخين محلول التهجين إلى 37 درجة مئوية قبل ساعة واحدة من الغسيل. ثم قم بتحميل الشرائح في وعاء من محلول غسيل التهجين واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لإزالة محلول التهجين ، اغسل العينات باستخدام PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

افعل هذا ثلاث مرات. بعد شفط آخر غسول PBST ، أضف 20 ميكرولترا من محلول الحجب لكل عينة واحتضنها في غرف رطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام. ثم استنشق محلول الحجب واستبدله بمحلول الأجسام المضادة المضادة للديجوكسيجينين المترافق من FITC عند واحد إلى 200.

قم بتغطية الشرائح واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات في الظلام. بعد بقعة الجسم المضاد ، اغسل العينات مرتين باستخدام PBST لمدة 15 دقيقة لكل غسلة في الظلام. بعد ذلك ، قم بشفط PBST واستبدله ب 10 ميكرولتر من محلول التركيب الذي يحتوي على DAPI.

ضع غطاء زجاجي وامتص أي محلول زائد. أخيرا ، أغلق حواف زجاج الغطاء بطلاء الأظافر واستمر في مراقبة العينات تحت المجهر الفلوري. باستخدام مسبار PNA ، لوحظت تيلوميرات التي نجت من طفرة كافية من التيلومير.

في الغدد التناسلية ، يمكن قياس عدد التيلوميرات لكل نواة. تم تحديد إشارة التيلومير مع إشارة TALT1 ، مما يدعم فكرة أن TALT1 مسؤول عن البقاء على قيد الحياة بدون تيلوميرات. تمت مقارنة شدة إشارة التيلومير باستخدام البرنامج.

كانت الإشارة أقوى في الناجين من ALT مقارنة بالسلالات الأبوية المستخدمة لتوليد الطفرات التي تعاني من نقص التيلوميرات. لا تنس أن العمل مع بارافورمالديهايد والفورماميد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء القفازات ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.