طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط
August 28th, 2016
يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة لاستخراج وتجزئة النصوص من الأنسجة النباتية على أساس عدد الريبوسومات المقلدة. يسمح بتقدير عالمي لنشاط الترجمة وتحديد الحالة الانتقالية لأنواع mRNAs محددة.
مرحبا ، أنا سيسيل. أنا أعمل في LGBP في مرسيليا. البروتوكول الذي سنصفه في هذا الفيديو هو طريقة بسيطة لعزل البوليسومات والأحاديات من الأنسجة النباتية المختلفة من أجل تحديد mRNAs التي تتم ترجمتها بنشاط ودراسة تنظيم الترجمة.
على سبيل المثال ، سنعرض لك عزل كثرة الجسيمات من شتلات نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا البالغة من العمر ستة أيام ، والعزل اللاحق للحمض النووي الريبي وتحليل النتائج. زرع البذور على الطبق واتركها يومين عند أربع درجات. ثم قم بزراعة النباتات خلال ستة أيام.
احصد الشتلات وطحنها في النيتروجين السائل. وزن 300 ملليغرام من مسحوق النبات وإضافة 2.4 ملليلتر من مخزن البوليسوم. جهاز طرد مركزي لجمع شظايا النبات وتحميل المادة الطافية على الجزء العلوي من تدرج السكروز.
ثميقوم التدرج الفائق بأجهزة الطرد المركزي بتجميعه من الأسفل إلى الأعلى مع القراءة المستمرة للOD. اسحب الكسر إلى كثرة ، أحادية اللون وجزء طافي وترسيب الحمض النووي الريبي بين عشية وضحاها. جهاز طرد مركزي فائق ، قم بإعادة تعليق الحبيبات واستخراج الحمض النووي الريبي للتحليل اللاحق. قبل أيام قليلة من إجراء التنميط متعدد الأشكال ، قم بإعداد تدرج السكروز.
قم بإعداد محلول السكروز 50 و 35 و 20٪ واحتفظ بها عند أربع درجات. صب طبقة السكروز بنسبة 50٪. قم بتجميده في فريزر 40 تحت الصفر.
بعد ست ساعات ، أضيفي طبقة 35٪ وقم بتجميدها في فريزر ناقص 40 طوال الليل. صب أول طبقة 20٪ وتجميدها. في يوم التجربة ، قم بإزالة العدد الضروري من التدرجات من الفريزر.
أضف آخر 20٪ طبقة من السكروز واترك التدرجات تذوب في غرفة باردة. تحضير العينة التي جمعناها حديثا النبات. هنا ، نستخدم شتلات أرابيدوبسيس ثاليانا عمرها ستة أيام.
احصد النباتات المجمدة بالنيتروجين السائل وطحنها جيدا. الوزن 300 ملليغرام من مسحوق النبات. أضف بسرعة 2.4 مل من محلول البوليسوم الطازج والتجانس.
ماصة المحلول في أنبوبين سعة 1.5 مل. الطرد المركزي مستخلص العصارة الخلوية. الماصة طاف.
احرص على تجنب شظايا النبات. سوف يفسدون الملف الشخصي في الخطوة التالية. قم بتحميل المادة الطافية على تدرج السكروز دون تعطيل التدرج.
ضع التدرج في دلو دوار SW 41. الطرد المركزي. لتصور ملف تعريف متعدد الجسيمات وجمع الكسر ، نستخدم نظاما بسيطا مصنوعا من أنبوب شعري يغرق في التدرج. إنه مرتبط بكوفيت الأشعة فوق البنفسجية.
إنه متصل ذاتيا بمضخة تمعجية. يسجل مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية باستمرار OD كتقدم التدرج عبر الكوفيت. يسمح مجمع الكسر بجمع جزأين من المليلتر.
نظف الكوفيت وضعه في مقياس الطيف الضوئي. قم بإزالة التدرج من الجرافة دون إزعاجه. يجب أن تتركز الكلوروفيل في الجزء العلوي من التدرج.
اغمر الأنابيب الشعرية في أسفل التدرج. ابدأ تشغيل المضخة التمعجية. يتم جمع التدرج من الأسفل إلى الأعلى ويتم قراءة OD باستمرار.
يتم جمع جزأين من المليلتر. هنا هو شكل الملف الشخصي الكلاسيكي. يتم تنفيذ ترسيب الحمض النووي الريبي باستخدام هيدروكلوريد الجوانيدينيوم والأيزوبروبانول.
أولا ، صب حجما واحدا من هيدروكلوريد غوانيدينيوم في أنبوب سعة 50 مليلتر ثم أضف الكسر. ثم أضف 1.5 حجم من الأيزوبروبانول و 50 ميكروغرام ساعي متساو. قم بترسيب الحمض النووي الريبي بين عشية وضحاها عند 20 درجة تحت الصفر.
انقل الكسور إلى أنابيب طرد مركزي فائق سعة 40 مليلتر ووازن الأنبوب مع الأيزوبروبانول. الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية وجفف الحبيبات في الهواء. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE الدافئ.
استخرج الحمض النووي الريبي بشكل أكبر عن طريق إجراء استخراج كلوروفورم الفينول الكلاسيكي. يظهر هنا ملف تعريف تمثيلي للعدسات المستخرجة من نبات الأرابيدوبسيس الشتلات التي يبلغ عمرها ستة أيام. تتوافق الذروة الرئيسية مع الأحادي ، الرنا المرسال المرتبط بريبوسوم واحد.
يتوافق الجزء الأول من الملف الشخصي مع الكسور متعددة الأجسام وهي mRNA المرتبطة بالعديد من الريبوسومات. تتطابق كل ذروة مع ارتباط الريبوسوم الجديد ب mRNA. يتوافق الجزء الأخير من الملف الشخصي مع ما يسمى بالجزء الطافي الذي يحتوي على الوحدات الفرعية الريبوسومية الحرة والحمض النووي الريبي.
تشكل كمية كبيرة من الوحدة الفرعية 60S كتفا بجوار القمة الأحادية. لتقييم سلامتها ، يمكن تشغيل الحمض النووي الريبي المستخرج من الكسور على هلام أراغوز كلاسيكي قبل استخدامه لمزيد من التجارب. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لعزل البوليسومات من شتلات نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا ، ولكن أيضا من الورود الصغيرة والكبيرة وكذلك من أوراق نيكوتيانا بنثاميانا والطماطم والأرز لذلك يجب أن تعمل مع مجموعة واسعة من النباتات والأنسجة.
تتوافق الحمض النووي الريبي المنقى مع تحليل المصفوفة الدقيقة وكذلك لتحديد الحمض النووي الريبي الصغير المرتبط بكسور متعددة الحدود.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل البوليسوما والمونوسموما من أنسجة النباتات، مما يسمح بتحديد mRNAs التي يتم ترجمتها بنشاط ودراسة تنظيم الترجمة. يركز المثال المقدم على عزل البوليسوما من شتلات Arabidopsis thaliana التي يبلغ عمرها ستة أيام.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا النبات
- تنظيم الترجمة
- تحليل mRNA
الخلفية
- فهم نشاط الترجمة أمر بالغ الأهمية لدراسة التعبير الجيني.
- البوليسوما هي مجموعات من الريبوسومات التي تترجم mRNA، بينما المونوسموما هي ريبوسومات فردية.
- توفر هذه الطريقة رؤى حول الحالة الترجمة لمRNAs معينة.
- Arabidopsis thaliana تعمل ككائن نموذجي في أبحاث النباتات.
غرض الدراسة
- لعزل البوليسوما والمونوسموما من أنسجة النباتات.
- لتحديد mRNAs التي يتم ترجمتها بنشاط.
- لدراسة تنظيم الترجمة في النباتات.
الطرق المستخدمة
- بذر البذور على ألواح وطبقتها الباردة لمدة يومين.
- زراعة الشتلات لمدة ستة أيام في ظروف مثالية.
- عزل البوليسوما والمونوسموما من أنسجة النباتات.
- تحليل الحمض النووي الريبي لتحديد نشاط الترجمة.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للبوليسوما من شتلات Arabidopsis thaliana.
- تحديد mRNAs التي يتم ترجمتها بنشاط.
- رؤى حول تنظيم الترجمة في أنسجة النباتات.
- تبيين فعالية الطريقة لدراسة الترجمة.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة الترجمة في النباتات.
- يعزز فهم تنظيم التعبير الجيني.
- يمكن تطبيق النهج على أنواع مختلفة من النباتات.
