طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط

مرحباً، أنا سيسيل. أعمل في مختبر LGBP في مارسيليا. البروتوكول الذي سنشرحه في هذا الفيديو هو طريقة بسيطة لعزل البوليسومات والمونوسومات من أنسجة نباتية مختلفة، وذلك من أجل تحديد جزيئات mRNA التي يتم ترجمتها بنشاط ودراسة تنظيم عملية الترجمة.

على سبيل المثال، سنوضح لكم كيفية عزل البوليسومات من شتلات نبات Arabidopsis thaliana في عمر ستة أيام، يتبع ذلك عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) وتحليل النتائج. ازرع البذور في أطباق واتركها لمدة يومين في درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، اترك النباتات تنمو لمدة ستة أيام.

احصد الشتلات واطحنها في نيتروجين سائل. زن 300 mg من مسحوق النبات وأضف 2.4 mL من منظم البوليسوم. قم بإجراء عملية الطرد المركزي لجمع شظايا النبات، ثم ضع السائل العلوي على سطح تدرج السكروز.

يتم إجراء طرد مركزي فائق للتدرج، ثم يتم جمعه من الأسفل إلى الأعلى مع القراءة المستمرة للكثافة الضوئية (OD). يتم سحب الأجزاء المقسمة إلى جزء البوليسوم (polysome)، وجزء المونوسوم (monosome)، وجزء الراشح، ثم يتم ترسيب الـ RNA طوال الليل. يُجرى طرد مركزي فائق، ثم يُعاد تعليق الراسب ويُستخلص الـ RNA للتحليل اللاحق. قبل بضعة أيام من إجراء تحليل توصيف البوليسوم، يتم تحضير تدرج السكروز.

قم بتحضير محاليل سكروز بتركيز 50% و35% و20% واحفظها عند درجة حرارة 4 °C. صب طبقة السكروز بتركيز 50%. ثم قم بتجميدها في مجمد عند درجة حرارة -40 °C.

بعد مرور ست ساعات، أضف طبقة الـ 35% وجمدها في مجمد بدرجة حرارة -40 °C طوال الليل. صب طبقة الـ 20% الأولى وقم بتجميدها. وفي يوم التجربة، أخرج العدد المطلوب من التدرجات من المجمد.

أضف طبقة الـ 20% sucrose الأخيرة واترك التدرجات تذوب في غرفة باردة. قم بتجهيز العينة من النباتات التي تم جمعها حديثاً. نستخدم هنا بادرات Arabidopsis thaliana بعمر ستة أيام.

قم بحصاد النباتات المجمدة بالنيتروجين السائل واطحنها جيداً. زن 300 milligrams من مسحوق النبات. أضف سريعاً 2.4 milliliter من منظم polysome الطازج وقم بالتجانس.

انقل المحلول باستخدام الماصة إلى أنبوبين سعة 1.5 milliliter. قم بطرد مركزي للمستخلص السيتوسولي. ثم انقل الطافي باستخدام الماصة.

كن حذراً لتجنب شظايا النبات، حيث إنها قد تؤدي إلى إفساد المقطع في الخطوة التالية. قم بتحميل الطافي على تدرج السكروز دون إخلال بهذا التدرج.

ضع التدرج في دلو دوار من نوع SW 41. قم بإجراء عملية الطرد المركزي. ولتصوير ملف البوليسوم وجمع الكسور، نستخدم نظاماً بسيطاً يتكون من أنبوب شعري يغمس في التدرج، وهو متصل بخلية قياس UV.

يتم توصيله ذاتياً بمضخة 연动ية. ويقوم مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية بتسجيل الكثافة الضوئية OD باستمرار بينما يتقدم التدرج عبر الخلية. ويسمح جامع الكسور بجمع كسور بحجم مليتريْن.

قم بتنظيف الكيوفيت ووضعه في مقياس الطيف الضوئي. أزل التدرج من الوعاء دون تحريكه، حيث يجب أن تتركز الكلوروفيلات في الجزء العلوي من التدرج.

اغمس الأنابيب الشعرية حتى تصل إلى قاع التدرج. ابدأ بتشغيل المضخة 연동ية. يتم جمع التدرج من الأسفل إلى الأعلى مع القراءة المستمرة لـ OD.

يتم جمع أجزاء بحجم 2 mL. يظهر هنا شكل المخطط النموذجي. يتم إجراء ترسيب الـ RNA باستخدام guanidinium hydrochloride وisopropanol.

أولاً، صُب حجماً واحداً من guanidinium hydrochloride في أنبوب سعة 50 milliliter ثم أضف الجزء المخصص. بعد ذلك، أضف 1.5 حجماً من isopropanol و 50 microgram من courier مكافئ. قم بترسيب RNA طوال الليل عند درجة حرارة -20 degrees.

انقل الكسور إلى أنابيب طرد مركزي فائقة سعة 40 milliliter ووازن الأنبوب باستخدام الإيزوبروبانول. قم بإجراء الطرد المركزي. أزل الطافي وجفف الراسب هوائياً. أعد تعليق الراسب في 200 microliters من منظم TE الدافئ.

قم باستخلاص الـ RNA بشكل إضافي عن طريق إجراء عملية استخلاص تقليدية باستخدام الفينول والكلوروفورم. يظهر هنا ملف تعريفي نموذجي لمستخلص البوليسومات من بادرة Arabidopsis عمرها ستة أيام. وتتوافق القمة الرئيسية مع المونوسوم، وهو الـ mRNA المرتبط بريبوسوم واحد.

يتوافق الجزء الأول من المقطع العرضي مع الكسور البوليسومية، وهي جزيئات mRNA المرتبطة بالعديد من الريبوسومات. وتطابق كل ذروة عملية ارتباط ريبوسوم جديد بـ mRNA. أما الجزء الأخير من المقطع العرضي فيتوافق مع ما يسمى بكسر الراشح، والذي يحتوي على الوحدات الريبوسومية الفرعية الحرة وRNA.

تُشكل كمية كبيرة من الوحدات الفرعية 60S كتفاً بجانب ذروة المونوسوم. ولتقييم سلامتها، يمكن تشغيل الأحماض النووية الريبية (RNAs) المستخلصة من الكسور على هلام أرغوز (Aragose) تقليدي قبل استخدامها في تجارب إضافية. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لعزل البوليسومات من بادرات Arabidopsis thaliana، وأيضاً من الوردات الصغيرة والكبيرة، وكذلك من أوراق Nicotiana benthamiana والطماطم والأرز، لذا فمن المتوقع أن يعمل مع مجموعة واسعة من النباتات والأنسجة.

تتوافق أحماض RNA المنقاة مع تحليلات المصفوفات الدقيقة (micro array)، وكذلك مع عملية تحديد أحماض RNA الصغيرة المرتبطة بالكسور البوليسومية.