الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

الهدف من هذا الإجراء هو هندسة رفع الأنسجة ثلاثية الأبعاد المتطابقة المضمنة في هلام الكولاجين لاستخدامها في العديد من السياقات التجريبية ، مثل تحديد تأثير الإجهاد الميكانيكي على تكوين الأشكال المتفرعة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تشكل الأنسجة ، مثل تحديد الآليات الأساسية لسلوك الخلية الجماعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن هندسة الأنسجة المهندسة يتم التحكم فيها وقابليتها للتكرار ، مما يتيح معالجة وقياس العوامل الفيزيائية والكيميائية الحيوية بدقة.

وبالتالي ، فإن حجم العينة كبير بما يكفي بحيث يمكن التوصل إلى استنتاجات بثقة إحصائية عالية. ابدأ بإعداد سيليكون رئيسي منقوش بالمصفوفة التي تريدها باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الضوئية القياسية. يتكون النمط المستخدم في هذا الفيديو من هياكل مستطيلة متباعدة بمقدار 200 ميكرون.

بعد ذلك ، امزج 50 جراما من PDMS عن طريق الجمع بين البوليمر المسبق وعامل المعالجة في طبق يمكن التخلص منه بنسبة 10: 1. بعد ذلك ، ضع الخليط تحت الفراغ لمدة 15 إلى 30 دقيقة لإزالة أي فقاعات هواء تم إدخالها أثناء عملية الخلط. ضع الجانب الرئيسي من السيليكون لأعلى في قارب وزن بلاستيكي ، واسكب محلول PDMS منزوع الغاز أعلى القالب.

ثم ضع الطبق في الفرن وقم بمعالجة PDMS على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. بمجرد المعالجة ، قم بإزالة PDMS وماستر من الحاوية البلاستيكية. افصل PDMS بعناية عن رقاقة السيليكون.

بعد ذلك ، استخدم شفرة حلاقة نظيفة لإزالة أي PDMS زائدة من حول الميزات المطبوعة. الآن ، استخدم شفرة حلاقة لقطع PDMS المزخرفة إلى طوابع مستطيلة فردية. قم بتخزين هذه الطوابع في طبق بتري نظيف بقطر 100 ملم.

بعد ذلك ، قم بإعداد دفعة جديدة من محلول PDMS منزوع الغازات باستخدام نفس نسبة 10: 1 من البوليمر المسبق إلى عامل المعالجة. قم بتدوير جرامين إلى ثلاثة جرامات من هذا المحلول على طبق بتري بقطر 100 مم ، ثم عالج PDMS لمدة 12 ساعة عند 60 درجة مئوية. بعد ذلك ، استخدم شفرة حلاقة لقطع الطبقة الرقيقة من PDMS إلى مستطيلات لاستخدامها كدعامات للطوابع.

هناك حاجة إلى دعامتين لكل ختم. بمجرد قطع جميع الدعامات ، قم بتعقيم طوابع ودعامات PDMS عن طريق غمرها في 70٪ من الإيثانول وتجفيفها باستخدام شفاط في خزانة السلامة الحيوية. في خزانة السلامة الحيوية ، أضف 50 ميكرولترا من 1٪ BSA في PBS إلى الجزء العلوي من كل ختم.

ضع الطوابع المغطاة بالقطرات عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل للتأكد من امتصاص BSA على سطح الطابع. بعد ذلك ، أعد الطوابع إلى خزانة السلامة الحيوية واستنشق حل BSA من طوابع PDMS. بعد ذلك ، اغسل أسطح الطوابع مرتين باستخدام 50 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا.

استنشق الوسط بعد كل غسلة. ضع طبق واحد لزراعة الأنسجة بقطر 35 ملم لكل ختم PDMS. في كل طبق ، ضع دعامتين PDMS مفصولتين بمسافة أقل بقليل من طول طوابع PDMS.

بعد ذلك ، استخدم زوجا من الملقط لالتقاط زلات غطاء زجاجي قطرها 15 ملم وتعقيمها باستخدام 70٪ من الإيثانول. قم بشفط السائل الزائد من زلات الغطاء أثناء حملها بالملاقط ثم قم بتخزينها في طبق بتري منفصل. بعد ذلك ، قم بتوزيع 50 ميكرولترا من خليط الكولاجين بسعة أربعة ملليغرام لكل مليلتر مباشرة على كل ختم لتغطية سطح طوابع PDMS بالتساوي.

باستخدام الملقط ، التقط كل من طوابع PDMS المطلية بالكولاجين واقلبها برفق. قم بخفض جانب الكولاجين المقلوب لأسفل أعلى دعامات PDMS في أطباق زراعة الأنسجة. ثم احتضن الأطباق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتوزيع 50 ميكرولترا من خليط الكولاجين المتبقي على كل شريحة من شرائح الغطاء الدائري واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. في هذه المرحلة ، احصد نوع الخلية التي تهمك. هنا ، لدينا الخلايا الظهارية للثدييات الفأرية EpH4 قمنا بتعليقها بتركيز يتراوح بين واحد و 10 ملايين خلية لكل مليلتر.

الآن ، قم بإزالة عينات الكولاجين المتبلور من الحاضنة. باستخدام الملقط ، ارفع طوابع PDMS برفق لأعلى لفصلها عن الكولاجين المصبوب والتخلص منها. من المهم رفع الختم مباشرة لأعلى حتى لا تشوه الميزات الموجودة في جل الكولاجين.

قم بتوزيع 30 ميكرولترا من معلق الخلية المركز على سطح كل هلام كولاجين يحتوي على تجاويف مصبوبة من الهندسة المرغوبة. راقب الخلايا تحت مجهر المجال الساطع أثناء هز الأطباق برفق جنبا إلى جنب لتعزيز استقرار الخلايا داخل التجاويف. يجب ملء التجاويف في غضون خمس دقائق.

لإزالة الخلايا الزائدة من حول التجاويف ، قم بإمالة كل طبق مزرعة أنسجة على جانبه وقم بتوزيع 400 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا برفق على سطح هلام الكولاجين. من المهم أن تغسل بلطف عن طريق توزيع وسط الثقافة ببطء على الجل أثناء إمالة الطبق حتى تتم إزالة أي خلايا زائدة على سطح الجل ولا يتم إزاحة الخلايا الموجودة في تجاويف الجل. استنشق السائل وكرر الغسيل مرتين أخريين.

افحص المواد الهلامية الكولاجين الموجودة تحت المجهر بين كل غسلة لملاحظة متى تم شطف الخلايا الزائدة. بعد إزالة الخلايا الزائدة من حول التجاويف المملوءة بالخلايا ، ضع أطباق زراعة الأنسجة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، اقلب برفق زلات الغطاء الزجاجي المطلي بالكولاجين وضعها فوق قوالب الكولاجين المملوءة بالخلية بحيث يشكل الكولاجين من زلة الغطاء غطاءا فوق التجاويف المملوءة بالخلايا.

احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بمجرد أن تلتصق أغطية الكولاجين بقوالب الكولاجين المملوءة بالخلية ، قم بتوزيع اثنين إلى 2 1/2 مل من وسط زراعة الخلايا ببطء فوق الغطاء الزجاجي الذي ينزلق فوق المواد الهلامية وقم بزراعة العينات عند 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى ثلاثة أيام. هذه الصور مأخوذة من مناظر التكبير المنخفضة والعالية للمصفوفات المصبوبة في هلام الكولاجين من النوع الأول قبل بذر الخلايا.

يتم تحديد شكل الآبار من خلال شكل الميزات الموجودة على سيد السيليكون. هنا ، امتلأت الآبار المستطيلة بالخلايا الظهارية الثديية. في هذا المثال ، يحتوي كل بئر مستطيل 200 × 50 ميكرون على ما يقرب من 80 إلى 100 خلية.

بعد 24 ساعة من بذر الخلايا ، لوحظ أن الخلايا تلتصق ببعضها البعض داخل الآبار لتشكيل أنسجة. بعد 24 ساعة من إضافة عامل النمو HGF إلى وسط الاستزراع ، شوهدت الأنسجة تخضع لتشكل متفرع. أحد البروتينات المشاركة في هجرة الخلايا هو كيناز الالتصاق البؤري ، والذي كما ترون من هذه الصورة المركبة ، يزداد في نهايات الآبار حيث يحدث التفرع عادة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري لقوة الجر ، و RT-PCR في الوقت الفعلي ، و Western Blotting ، من أجل تحديد القوى التي تمارسها الخلايا أثناء هجرتها والتغيرات في مستويات النسخ والبروتين للجينات ذات الأهمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد نموذج زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد هذا الذي يتم فيه تضمين الأنسجة ذات الهندسة الأولية المحددة داخل هلام الكولاجين.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.