الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

الهدف من هذا الإجراء هو هندسة مجموعة من الأنسجة ثلاثية الأبعاد المتطابقة والمدمجة في هلام الكولاجين لاستخدامها في العديد من السياقات التجريبية، مثل تحديد تأثير الإجهاد الميكانيكي على تكوين التشعبات المورفولوجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في تكوين مورفولوجيا الأنسجة، مثل تحديد الآليات الكامنة وراء السلوك الخلوي الجماعي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن هندسة الأنسجة المصنعة تكون محكومة وقابلة للتكرار، مما يسمح بالتحكم الدقيق والقياس للعوامل الفيزيائية والكيميائية الحيوية.

وبذلك، يكون حجم العينة كافياً بحيث يمكن استخلاص الاستنتاجات بثقة إحصائية عالية. ابدأ بتجهيز قالب سيليكوني رئيسي بنمط ضوئي للمصفوفة المطلوبة باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الضوئية القياسية. يتكون النمط المستخدم في هذا الفيديو من هياكل مستطيلة تفصل بينها مسافة 200 microns.

بعد ذلك، اخلط 50 جراماً من PDMS عن طريق دمج البوليمر الأولي وعامل المعالجة في طبق مخصص للاستخدام مرة واحدة بنسبة 10:1. ثم، ضع الخليط تحت تفريغ هوائي لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة لإزالة أي فقاعات هواء قد تكون قد تكونت أثناء عملية الخلط. ضع القالب السيليكوني بحيث يكون الجانب المنسوج للأعلى في وعاء وزن بلاستيكي، ثم صب محلول PDMS منزوع الغاز فوق القالب.

بعد ذلك، ضع الطبق في الفرن وقم بمعالجة PDMS عند 60 °C لمدة 12 ساعة. وبمجرد اكتمال المعالجة، قم بإزالة PDMS والقالب الرئيسي من الحاوية البلاستيكية. افصل PDMS بعناية عن رقاقة السيليكون.

بعد ذلك، استخدم شفرة حلاقة نظيفة لإزالة أي فائض من الـ PDMS من حول الميزات المطبوعة. الآن، استخدم شفرة حلاقة لقطع الـ PDMS المنقوش إلى أختام مستطيلة فردية. تُحفظ هذه الأختام بحيث يكون جانب الميزات للأعلى في طبق بتري نظيف بقطر 100 millimeter.

بعد ذلك، قم بتحضير دفعة جديدة من محلول PDMS منزوع الغاز باستخدام نفس النسبة 10:1 من البوليمر التحضيري إلى عامل المعالجة. قم بطلاء دوراني لما يتراوح بين جرامين إلى ثلاثة جرامات من هذا المحلول على طبق بتري بقطر 100 مليمتر، ثم قم بمعالجة PDMS لمدة 12 ساعة عند 60 °C. بعد ذلك، استخدم شفرة حلاقة لقص الطبقة الرقيقة من PDMS إلى مستطيلات لاستخدامها كدعامات للأختام.

يلزم وجود دعامتين لكل ختم. بمجرد قطع جميع الدعامات، قم بتعقيم أختام ودعامات PDMS عن طريق غمرها في 70%ethanol وتجفيفها باستخدام جهاز شفط في كابينة السلامة البيولوجية. في كابينة السلامة البيولوجية، أضف 50 µL من 1%BSA في PBS إلى الجزء العلوي من كل ختم.

ضع الأختام المغطاة بالقطرات في درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل لضمان امتصاص BSA لسطح الختم. بعد ذلك، أعد الأختام إلى كابينة السلامة البيولوجية واشفط محلول BSA من أختام PDMS. تالياً، اغسل أسطح الأختام مرتين باستخدام 50 µL من وسط زراعة الخلايا.

قم بشفط الوسط بعد كل غسلة. جهز طبق زراعة أنسجة واحد بقطر 35 مليمتر لكل ختم PDMS. وفي كل طبق، ضع دعامتين من PDMS تفصل بينهما مسافة أقل قليلاً من طول أختام PDMS.

بعد ذلك، استخدم ملقطاً لالتقاط شرائح غطاء زجاجية بقطر 15 millimeter وعقمها باستخدام 70% ethanol. قم بشفط السائل الزائد من شرائح الغطاء أثناء إمساكها بالملقط، ثم خزنها في طبق بتري منفصل. بعد ذلك، وزع 50 µL من خليط كولاجين بتركيز 4 mg/mL مباشرة على كل ختم لطلاء سطح أختام PDMS بشكل متساوٍ.

باستخدام الملاقط، ارفع كل ختم من أختام PDMS المطلية بالكولاجين واقلبها برفق. ضع الأختام المقلوبة بحيث يكون جانب الكولاجين لأسفل فوق دعامات PDMS في أطباق زراعة الأنسجة. بعد ذلك، قم بحضن الأطباق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، وزع 50 µL من خليط الكولاجين المتبقي على كل شريحة غطاء دائرية، ثم حضنها عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. في هذه المرحلة، قم بحصاد نوع الخلايا المطلوب. هنا، لدينا خلايا EpH4 الطلائية الثديية للفئران التي قمنا بتعليقها بتركيز يتراوح بين 1 و 10 مليون خلية/mL.

الآن، قم بإخراج عينات الكولاجين المتجلطة من الحاضنة. وباستخدام الملاقط، ارفع أختام PDMS بلطف وبشكل عمودي للأعلى لفصلها عن الكولاجين المصبوب ثم تخلص منها. من المهم رفع الختم بشكل عمودي تماماً لتجنب تشويه المعالم في هلام الكولاجين.

قم بتوزيع 30 µL من معلق الخلايا المركز على سطح كل هلام كولاجين يحتوي على تجاويف مصبوبة بالهندسة المطلوبة. راقب الخلايا تحت مجهر المجال المضيء مع هز الأطباق بلطف من جانب إلى آخر لتعزيز استقرار الخلايا داخل التجاويف. يجب أن تمتلئ التجاويف في غضون خمس دقائق.

لإزالة الخلايا الزائدة من حول التجويفات، أَمِل كل طبق زراعة أنسجة على جانبه وصب 400 microliters من وسط زراعة الخلايا بلطف فوق سطح هلام الكولاجين. من المهم إجراء الغسيل بلطف عن طريق صب وسط الزراعة ببطء فوق الهلام أثناء إمالة الطبق، وذلك لضمان إزالة أي خلايا زائدة على سطح الهلام دون إزاحة الخلايا الموجودة في تجويفات الهلام. اشفط السائل وكرر عملية الغسيل مرتين إضافيتين.

افحص هلامات الكولاجين تحت المجهر بين كل عملية غسيل لملاحظة الوقت الذي تم فيه شطف الخلايا الزائدة. بعد إزالة الخلايا الزائدة من حول التجويفات المملوءة بالخلايا، ضع أطباق زراعة الأنسجة في حضانة عند 37 درجة Celsius لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، وباستخدام الملاقط، اقلب أغطية الشرائح الزجاجية المطلية بالكولاجين برفق وضعها فوق قوالب الكولاجين المملوءة بالخلايا، بحيث يشكل الكولاجين الموجود على غطاء الشريحة غطاءً فوق التجويفات المملوءة بالخلايا.

يتم تحضين العينات عند 37 °C لمدة 15 دقيقة. وبمجرد التصاق أغطية الكولاجين بقوالب الكولاجين المملوءة بالخلايا، يتم توزيع من 2 إلى 2.5 mL من وسط زراعة الخلايا ببطء فوق شرائح الغطاء الزجاجية الموجودة أعلى الهلامات، وتُزرع العينات عند 37 °C لمدة تتراوح من يوم واحد إلى ثلاثة أيام. هذه الصور مأخوذة من مشاهدات بتكبير منخفض وعالٍ للمصفوفات المصبوبة في هلام كولاجين من النوع I قبل استزراع الخلايا.

يتم تحديد شكل الآبار بناءً على شكل المعالم الموجودة على القالب الرئيسي من السيليكون. وهنا، تم ملء الآبار المستطيلة بخلايا ظهارية ثديية. وفي هذا المثال، يحتوي كل بئر مستطيل بأبعاد 200 by 50 micron على ما يقرب من 80 إلى 100 خلية.

بعد مرور 24 ساعة من استزراع الخلايا، لوحظ التصاق الخلايا ببعضها البعض داخل الآبار لتكوين نسيج. وبعد 24 ساعة من إضافة عامل النمو HGF إلى الوسط الزرعي، تظهر الأنسجة وهي تمر بعملية التخلق المتفرع. وأحد البروتينات المشاركة في هجرة الخلايا هو focal adhesion kinase، والذي كما ترى من هذه الصورة المركبة، يزداد تركيزه عند أطراف الآبار حيث يحدث التفرع عادةً.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ساعتين إذا نُفذت بشكل صحيح. وعقب هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل مجهرية قوة الشد (traction force microscopy)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل اللحظي (real time RT-PCR)، ولطخة ويسترن (Western Blotting)، وذلك لتحديد القوى التي تبذلها الخلايا أثناء هجرتها والتغيرات في مستويات النسخ والبروتين للجينات المستهدفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد نموذج المزرعة الخلوية ثلاثي الأبعاد هذا، والذي تُدمج فيه أنسجة ذات هندسة أولية محددة داخل هلام الكولاجين.

شكرًا للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.