الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

الهدف العام من هذه الطريقة لصنع الهلاميات المائية المخصصة هو دراسة الخلايا وظروف الثقافة التي تكرر تعقيد مصفوفة الرئة خارج الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الرئوي مثل كيفية تفاعل خلايا الرئة مع ECM في ظل ظروف صحية ومرضية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الهلاميات المائية للرئة ECM قابلة للتخصيص وفقا لتطبيقك في ثقافة ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب تعقيد تقنيات إزالة الخلايا ، مما يتطلب أحيانا عدة أشخاص واهتماما بالتفاصيل لتحسين كمية الأنسجة القابلة للحياة. بالنسبة لهذا البروتوكول ، جهز رئة خنزير جاهزة لإزالة الخلايا. يمكن العثور على تفاصيل حول إعداده في بروتوكول النص.

بمجرد تحضير الرئة ، استخدم مضخة يدوية معلقة لتناسب الشريان الرئوي. أولا ، قم بصب حوالي لتر واحد من الماء في الأوعية الدموية ، ثم 1.5 لتر في القصبة الهوائية. افعل ذلك ثلاث مرات ، مما يزيد من حجم الماء الذي يتم نقله عند إزالة الحطام الخلوي.

بعد ذلك ، قم بتنقيم الأنسجة باستخدام Triton X-100 ، باستخدام المضخة اليدوية أيضا. بعد ذلك ، اغمر الأنسجة في حمام بمحلول Triton X-100 عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، اشطف الأوعية الدموية والقصبة الهوائية ثلاث مرات بالماء المقطر.

بعد الشطف ، استخدم المضخة اليدوية لنفخ الأنسجة بمنزي الأكسجين كولات. ثم اغمر الأنسجة في ديوكسي كولات لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اشطف المنديل ثلاث مرات بالماء المقطر ، كما كان من قبل.

بعد الشطف ، استخدم المضخة اليدوية لنفخ الأنسجة بكلوريد الصوديوم المصفى. ثم اغمر الأنسجة في كلوريد الصوديوم المصفى لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد الاستحمام ، قم بحشو الأوعية الدموية والقصبة الهوائية ثلاث مرات بالماء المقطر لشطفها.

بعد الشطف ، قم بنقف الأنسجة بمحلول DNase ، ثم اغمرها في محلول DNase لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد ساعة ، قم ببث الأوعية الدموية والقصبة الهوائية خمس مرات باستخدام PBS ، وليس الماء. الآن ، باستخدام أنسجة بيضاء غير شفافة فقط ، قم بتشريح جميع الأنابيب التي يبلغ قطرها ملليمترين أو أكبر.

توجد بشكل أساسي حول النقير والأجزاء الإنسية من الرئتين. اترك مناطق الجهاز التنفسي سليمة ، والتي تكون في الغالب في الأطراف. بعد إزالة الأنابيب ، قم بتشريح الأنسجة إلى أقسام بوصة واحدة أو أصغر.

اتجاه هذه الكتل ليس مهما. بعد تصريف كتل الأنسجة ، انقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وقم بتجميدها عند 80 درجة مئوية. يمكن تخصيص بعض الكتل لعلم الأنسجة لتأكيد إزالة الخلايا والحطام.

لمعالجة أنسجة الرئة إلى مسحوق منزوع الخلايا ، استبدل الغطاء الموجود على أنبوب المناديل المجمدة بورق ترشيح ، وقم بتثبيته بشريط مطاطي. بعد ذلك ، قم بتجميد الأنسجة حتى يختفي كل السائل الزائد باستخدام مجفف التجميد وفقا لتوجيهات المصنع. ثم قم بتخزين الأنسجة على حرارة 80 درجة مئوية حتى يمكن طحنها.

لتجهيز المطحنة ، قم أولا بتحميلها بالنيتروجين السائل ، مع ترك مساحة لأنبوب المطحنة. بعد ذلك ، من أنبوب المطحنة ، قم بإزالة شريط المطحنة المغناطيسي وقم بتغطية الجزء السفلي من الأنبوب بالأنسجة. بعد ذلك ، استبدل قضيب المطحنة وقم بتعبئة المزيد من الأنسجة بشكل غير محكم لملء الأنبوب.

ثم أغلق أنبوب المطحنة ، وضعه في الفريزر / المطحنة ، واملأ المطحنة بالنيتروجين السائل حتى سعتها القصوى. الآن ، قم بتشغيل المطحنة لمدة خمس دقائق تقريبا بمعدل انحطاط يبلغ حوالي 600 في الدقيقة. ثم قم بتخزين المسحوق منزوع الخلايا على حرارة 80 درجة مئوية ، لحين الحاجة.

لصنع مادة ما قبل الهلام ، أضف مسحوق الأنسجة منزوعة الخلايا والبيبسين إلى أنبوب مخروطي الشكل. ثم أضف 0.01 حمض الهيدروكلوريك المولي إلى الأنبوب ، للحصول على تركيز نهائي من 1٪ مسحوق الأنسجة منزوعة الخلايا ، و 0.01٪ بيبسين. احتفظ بهذا المحلول تحت التحريك المستمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة لهضم الأنسجة.

بعد 48 ساعة ، ضع المحلول على الجليد لمدة خمس دقائق. الآن اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم البارد 0.1 مولار، ثم ارفع تركيز PBS للمحلول إلى 1X بإضافة 10X PBS. لدينا بعض الخبرة في تغيير الأوقات ودرجة الحموضة في الجل المسبق.

هناك بعض المرونة في النطاق الذي يمكن استخدامه ، ولكن يمكن أن تتغير الخصائص بشكل كبير إذا تم تغيير الإجراء بطرق طفيفة. لا يعتبر المحلول قبل الهلام ويمكن استخدامه لتغطية الألواح غير المعالجة لتشكيل الهلاميات المائية لتشكيل الخلايا عليها ، لتشكيل الهلاميات المائية لتشكيل الخلايا فيها ، أو يمكن تعديلها بشكل أكبر قبل تشكيل الهلاميات المائية لزيادة صلابة الهلاميات المائية. لزراعة الخلايا على طلاء جل مسامي دقيق ثنائي الأبعاد ، أضف 20 ميكرولترا من محلول ما قبل الهلام إلى آبار لوحة زراعة الأنسجة غير المعالجة المكونة من 96 بئرا.

بعد ذلك ، قم بتبريد الطبق طوال الليل عند أربع درجات مئوية حتى يتم امتصاص البروتينات على الطبق. في اليوم التالي ، قم بشفط محلول ما قبل الهلام واشطف الآبار باستخدام PBS. ثم أضف 3 ، 200 خلية إلى كل بئر وقم بتعبئة حجم الوسائط في كل بئر إلى 100 ميكرولتر.

يمكن بعد ذلك تحضين الألواح. للحصول على ثقافة خلوية ثلاثية الأبعاد مع خلايا داخل الجل المسامي الصغير ، أعد تعليق الخلايا ذات الأهمية بمعدل مليون لكل مليلتر في محلول ما قبل الهلام. بعد ذلك ، قم بتوزيع 16 ميكرولترا من تعليق الخلية بسرعة في كل بئر من صفيحة 96 بئرا لتشكيل ثقافة خلية ثلاثية الأبعاد يبلغ سمكها حوالي 500 ميكرون.

سيتشكل الجل في غضون 30 دقيقة بمجرد تحضينه عند 37 درجة مئوية. بعد تشكيل المواد الهلامية ، أضف وسائط إلى الآبار حتى علامات 100 ميكرولتر. للحصول على ثقافة خلوية ثلاثية الأبعاد مع خلايا أعلى الجل المسامي الدقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول ما قبل الهلام إلى آبار صفيحة 96 بئرا غير معالجة.

ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للهلام. بمجرد أن تتشكل المواد الهلامية ، أضف 3،200 خلية في وسائط سعة 100 ميكرولتر أعلى الهلاميات المائية واستمر في احتضان اللوحة. تم إنتاج الهلاميات المائية من رئتي الخنازير والجرذان والفئران الطبيعية باستخدام الطريقة الموصوفة.

أكد الاختبار الريولوجي أن أكثر من 90٪ من التبلور يحدث في الدقائق الأولى بعد الوصول إلى 37 درجة مئوية. كانت الهلاميات المائية المتكونة مستقرة لفترات طويلة في PBS ، ولكن قد يتغير ارتباط الخلايا وتكاثرها بمرور الوقت. تم اختبار محلول ما قبل الهلام كترميز لتحسين ارتباط الخلية.

تم قياس ارتباط الخلايا البطانية للوريد السري البشري وتكاثره باستخدام MTTSA. لوحظت التحسينات من خلال طلاء الآبار ب ECM. في صنع المواد الهلامية ثلاثية الأبعاد ، زادت إضافة جينيبين من تشابك الهيدروجيل.

باستخدام عمليات مسح التردد على مقياس الريومتر ، ارتبطت صلابة الهيدروجيل ارتباطا مباشرا بتركيز جينيبين ، حيث كان التركيز المتوسط والأكثر صلة بنسبة 0.01٪ عند اختبار المواد الهلامية الأكثر صلابة ، تم قياس تكاثر الخلايا ليكون أعلى بواسطة MTTSA على المواد الهلامية مع زيادة التشابك. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء إزالة الخلايا في ثماني ساعات على مدار أربعة أيام. يمكن صنع محلول ما قبل الهلام في ساعة واحدة على مدار يومين ، ويمكن تكوين الجل في ساعتين على مدار يومين.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل AFM ، والبقع الغربية ، والتلوين ، والكيمياء المناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل معامل المرونة وتكوين البروتين والاستجابة الخلوية للمادة.