تحديد الأنواع والكميات في مخاليط عن طريق MRM الطيف الكتلي من الببتيدات التطبيقية للمصادقة اللحوم

الهدف العام لهذه الطريقة هو استخدام مطياف الكتلة لمراقبة التفاعل المتعدد لتحديد الأنواع الموجودة في مخاليط اللحوم النيئة وتحديدها كميا لاستخدامها كأداة للكشف عن الاحتيال الغذائي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال سلامة الغذاء ، مثل تأكيد الأنواع الموجودة في منتجات مثل النقانق أو البرغر. يعتمد نهجنا على قياس الطيف الكتلي لمكون البروتين.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تعطي نتيجة سريعة وكمية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أن البروتينات المعروفة بنفس الاسم والأنواع المختلفة مختلفة في الواقع بما يكفي لتحديد الأنواع ، ولكنها متشابهة بما يكفي للسماح بالكمية. يقوم بتغيير طبيعة الميوغلوبين المرجعي المنقى حراريا عن طريق تسخين العينة في كتلة ساخنة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

قم بتبريد العينة لمدة 15 دقيقة تقريبا حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 30 ملليغرام من اليوريا لتعزيز الهضم والخلط. أضف محلول التربسين إلى العينة بنسبة واحد إلى 30 من الإنزيم إلى الركيزة بالوزن.

ثم اخلطيها عن طريق دوامة لطيفة واتركيها تتحلل البروتين طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتحلية عينة ما بعد التحلل البروتيني عن طريق تخفيف العينة أولا من حجم إلى حجمها بالماء. قم بتنشيط خرطوشة الطور المعكوس البوليمرية المملوءة ب 30 ملليغرام من المواد ذات الطور العكسي عن طريق إضافة مليلتر واحد من الميثانول.

ثم قم بموازنة الخرطوشة بإضافة مليلتر واحد من حمض الفورميك بنسبة واحد. قم بتحميل العينة على الخرطوشة تحت الجاذبية. الآن يغسل بملليلتر واحد من خمسة بالمائة من الميثانول الذي يحتوي على واحد بالمائة من حمض الفورميك.

قم بتقطيع الببتيدات بمليلتر واحد من ماء الأسيتونيتريل إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المملوءة مسبقا بخمسة ميكرولتر من DMSO. بعد ذلك ، قم بإزالة المذيب تحت الفراغ عند 50 درجة مئوية باستخدام مبخر الطرد المركزي لمدة 120 دقيقة. ثم أعد إذابة البقايا في 250 ميكرولتر من ماء الأسيتونيتريل.

انقل المحلول إلى قارورة أخذ العينات التلقائية منخفضة الحجم. حدد موقع تسلسلات الميوغلوبين للاجتماعات المختلفة في قاعدة بيانات UniProt. أدخل تسلسلات الميوغلوبين في المربع المستهدف لبرنامج التنبؤ بالببتيد والانتقال.

إذا لزم الأمر ، مرر مؤشر الماوس فوق الببتيد للكشف عن قائمة الأجزاء الخاصة به. بعد إدخال التفضيلات كما هو موضح في بروتوكول النص ، انقر فوق تصدير وحدد قائمة الانتقال لإنشاء جدول بيانات يحتوي على انتقالات ومعلمات MRM التي تم إنشاؤها. قم بإعداد نظام كروموتوغرافيا سائلة عالي الأداء أو نظام HPLC للتدرج الثنائي مع جهاز أخذ العينات التلقائي وعمود HPLC ذو الغلاف الأساسي C18 المتصل بمطياف كتلة رباعي الأقطاب ثلاثي الأقطاب يعمل في وضع الرش الكهربائي الإيجابي مع اكتشاف MRM.

في قسم تحرير المعلمات في برنامج جمع بيانات قياس الطيف الكتلي للكروموغرافيا السائلة ، حدد نوع المسح الضوئي ك MRM والقطبية على أنها موجبة. أدخل قيم Q1 و Q3 و الوقت و ID و DP و CE للانتقالات التي تم إنشاؤها في جدول البيانات واحفظ طريقة الاكتساب. بعد إعداد معلمات الطريقة كما هو موضح في بروتوكول النص ، انتقل إلى برنامج جمع البيانات ، وانقر فوق الحصول على وحدد التوازن.

في المربع الذي يفتح، حدد طريقة الاستحواذ المطلوبة لبدء موازنة الأداة. بعد ذلك ، ضع قوارير العينة في رف في جهاز أخذ العينات التلقائي. انقر فوق ملف وحدد جديد ، متبوعا بدفعة الاستحواذ.

في اسم العينة، أدخل هوية كل عينة من العينات المراد تحليلها. راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل حول كيفية تصور البيانات المكتسبة. استخدم اللحم الذي تم تجميده مسبقا ثم طحنه إلى مسحوق.

قم بإعداد مجموعة من مخاليط اللحوم عن طريق وزن كميات اللحوم الخاصة في أنابيب طرد مركزي بلاستيكية سعة 15 مل. أضف أربعة ملليلتر من مخزن الاستخراج إلى مسحوق اللحم. بعد الدوامة لمدة 30 ثانية ، استخرج على شاكر المختبر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين بمعدل 250 دورة في الدقيقة.

انقل ملليلترين من المستخلص إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترين وجهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية و 17 ، 000 جم ، ونقل 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي. جفف العينات باستخدام مبخر الطرد المركزي قبل تحديد تركيز البروتين للعينات كما هو موضح في بروتوكول النص. لإجراء التحلل البروتيني لمخاليط اللحوم ، أعد إذابة البقايا المجففة في مليلتر واحد من محلول بيكربونات الأمونيوم 25 ملليمول.

تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتؤدي الانحلال البروتيني كما كان من قبل. ثم قم بإعداد LCMS وتشغيله بطريقة مماثلة باستخدام MRM المجدول. اعرض الكروماتوجرام الكامل في برنامج عرض البيانات.

اعرض الأيونات المستخرجة لكل مجموعة انتقال بدورها. تأكد بصريا من أن كل مجموعة تحتوي على العدد المطلوب من القمم على شكل جرس في وقت الاستبقاء المتوقع. وبالتالي تأكيد وجود الببتيد المحدد.

بعد ذلك ، انقر نقرا مزدوجا فوق معالج Quantiation في شريط التنقل. في النافذة تحديد العينات، قم بإنشاء مجموعة الكمية عن طريق تحديد ملف بيانات واحد. ثم حدد عينة واحدة أو أكثر من العينة المتاحة.

حدد التالي لعرض إعدادات التحديد ومربع الاستعلام. اترك الإعدادات الافتراضية وحدد التالي لعرض تحديد الأسلوب. من مربع طريقة القائمة المنسدلة ، حدد ملف طريقة التكامل ، وأخيرا حدد إنهاء.

احفظ جدول النتائج ، وقم بتصديره كملف نصي ، وافتحه في جدول بيانات لمراجعة البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. يوضح هذا الشكل التحولات الأكثر كثافة للخيول التي تم الحصول عليها من وزن واحد بالمائة لخليط الوزن مع اللحم البقري. في المقابل ، يظهر الخط الأحمر الانتقال من لحم البقر عندما لا يكون هناك حصان.

هذه قطعة أرض للكمية المقاسة مقابل الكمية المحضرة من الحصان في لحم البقر معبرا عنها بنسب. توضح المؤامرة بوضوح كيف يمكن استخدام الطريقة لإجراء القياسات الكمية. بمجرد إتقان وعند استخدام معالجة الدفعات ، يمكن أن يصل الإنتاجية بهذه الطريقة إلى ما يصل إلى 20 عينة لكل 24 ساعة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختيار بروتين مناسب لتحليل الاستخراج. يعتبر الميوغلوبين مرشحا جيدا لفحص أنواع اللحوم الحمراء لأنه وفير وقابل للذوبان في الماء ومستقر للحرارة. يمكن توسيع هذا الإجراء ليشمل المزيد من الأنواع التي سيتم تحديدها وتحديدها كميا في وقت واحد.

الأقصى للرقم محدود فقط من خلال سرعة مسح الطيف الكتلي. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لاستخدام بصمات البيبتو في مجالات مثل حماية المستهلك والعلامة التجارية.