الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

الهدف العام من الإجراء التالي هو عزل الببتيدات وتحديدها في خليط معقد يعمل كبدائل للبروتين الخاص بها. أولا ، يتم هضم البروتينات الكبيرة داخل الخليط لتكوين الببتيدات باستخدام إنزيم مثل التربسين. ثم يتم إثراء تحليلات الببتيد المستهدفة ونظير مستقر مسنن معيار داخلي باستخدام الأجسام المضادة للببتيد المضادة ، والتي يتم تثبيتها على الجسيمات المغناطيسية المشفرة للبروتين G بعد العزل.

يتم التلميح إلى الببتيدات المستهدفة من الجسيمات المغناطيسية وتحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي للقياس الكمي بالنسبة للمعيار الداخلي. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل المقايسات المناعية التقليدية في أنها أسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة في بناء أعداد كبيرة من المقايسات. لديها معدل نجاح مرتفع ويتم تعدد الإرسال بسهولة مما يدل على أنه سيتم وضع الإجراء.

فني في المختبر Haw 10 ميكرولتر بلازما Eloqua على الجليد الرطب. انقل العينة إلى صفيحة بئر بعمق 1000 ميكرولتر وقم بتغطيتها بغشاء مثل لتغيير طبيعة البروتينات عند 20 ميكرولترا من اليوريا الطازجة ذات التسعة مولار 30 ملليمولار DTT لكل عينة واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، أضف ثلاثة ميكرولترات من 500 ملليمولار I oto acetamide الطازج إلى كل عينة واحتضانها لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. الآن قم بتخفيف اليوريا إلى 0.6 مولار مع 100 مللي مولار ثلاثية الرقم الهيدروجيني ثمانية ، وأضف 10 ميكرولتر من ميكروغرام واحد لكل رحلات ميكرولتر ومحلول مخزون لنسبة إنزيم إلى 50 إلى الركيزة.

بعد احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها عند ثلاثة ميكرولترات من حمض الفورميك الأنيق إلى التركيز النهائي بنسبة 1٪ ، استمر في إضافة معيار النظير المستقر أو معايير متعددة. في حالة إجراء فحص متعدد الإرسال ، اغسل لوحة خرطوشة الواحة جيدا باستخدام 500 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ في 80٪ من النتريل ACE للتخلص من التدفق من خلاله. ثم قم بموازنة لوحة الخرطوشة بإضافة 500 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ في الماء وتخلص من التدفق من خلاله.

قم بتحميل عينات الهضم على لوحة الخرطوشة واضبط الفراغ بحيث يكون التدفق بطيئا جدا. اغسل ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ في الماء وتخلص من التدفق من خلال التخلص من الببتيدات مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ في تجربة أسيتو 80٪ ، ثم تجميد أو تسريع التميص إلى الجفاف وإعادة تكوين الببتيدات المجففة في 50 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى 0.03٪ الفصول نقل العينات إلى لوحة بئر Kingfisher 96 القياسية إضافة ميكروغرام واحد من الجسم المضاد و 1.5 ميكرولتر من البروتين G حبات مغناطيسية مشفرة لكل هدف. دوامة الخرز قبل الإضافة.

للتأكد من أن الخرزات معلقة بشكل جيد. غطي الطبق بورق الألمنيوم واحتضنه طوال الليل باستخدام جهاز طرد مركزي لطيف. اللوحة عند 400 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان لإزالة أي سائل من سطح الرقائق.

قم بإزالة غطاء القصدير. يحدث التلاعب بالعينة على منصة الرفراف الآلية على منصة الرفراف الرفراف اغسل الخرزات مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى 0.03٪ فصول ومرة واحدة ب 200 ميكرولتر من واحد إلى 10 تخفيف من PBS بالإضافة إلى 0.03٪ الفصول الآن تتخلص من الببتيدات مع 25 ميكرولتر من حمض الأسيتيك 5٪ بالإضافة إلى 0.03٪ فصول.

ضع لوحة الشطف على مغناطيس وانقل المصفاة إلى لوحة بئر 96 مع الحرص على عدم نقل الخرز المتبقي. قم بتغطية اللوحة بحصيرة السقف ، وقم بتسليم هذه اللوحة التي تحتوي على التصفيص إلى مطياف الكتلة الثلاثي الرباعي للتحليل. يتم إنشاء طريقة MRM عن طريق الحصول على طيف كتلي ترادفي للببتيد محل الاهتمام بدلا من اختيار وتحسين أفضل أيونات الشظايا الانتقالية.

عادة ما يستخدم تكوين تحليل MRM ملائمة C 18 وأعمدة تحليلية بمرحلتين متنقلتين. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة وقم بإزالتها بواسطة تدرج خطي. دمج مناطق الذروة للببتيدات الخفيفة والثقيلة ، وحساب نسبة مساحة الذروة للببتيد غير المسمى إلى الببتيد المسمى في كل عينة.

تتخلص الببتيدات الخفيفة والثقيلة في نفس الوقت ويمكن مراقبة التحولات المتعددة لكل ببتيد لتأكيد الهوية ، يتم قياس مساحة الذروة للببتيد الداخلي بالنسبة لمنطقة المعيار الداخلي لتوفير مقياس كمي للببتيد المستهدف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ هذه التقنية في مختبرك. يمكن استخدامه لتحديد أي بروتين ذي أهمية ، مما يجعله مناسبا لمجموعة واسعة من التطبيقات في البحث البيولوجي.