والطريقة غير الغازية ومن الناحية الفنية غير كثيفة للتحريض وPhenotyping التجريبية البكتيرية والالتهاب الرئوي في الفئران

الهدف العام من هذا البروتوكول التجريبي هو توفير إجراء غير جراحي وغير مكثف من الناحية الفنية لإحداث الالتهاب الرئوي الجرثومي في الفئران والقياس الكمي اللاحق للاستجابة الدفاعية للمضيف في الجسم الحي في الرئتين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الأمراض المعدية والمناعة ، حول الجينات والمسارات الجزيئية التي تتحكم في استجابة المضيف للعدوى. الميزة الرئيسية لطريقة عدوى الرئة هذه هي بساطتها التقنية.

مما يسمح حتى للمختبرات ذات الخبرة القليلة في الإجراءات الرئوية بدراسة الاستجابة المناعية الفطرية الرئوية. في منشأة السلامة الحيوية من المستوى الثاني ، قم بإذابة مخزون الجلسرين من K.pneumoniae ونقل مليلتر واحد من البكتيريا إلى قارورة مزرعة سعة 500 مل تحتوي على 50 مل من مرق الصويا الترابتي. احتضن ثقافة التعليق طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 200 إلى 225 دورة في الدقيقة.

في صباح اليوم التالي ، قم بتخفيف واحد إلى خمسة ملليلتر من المزرعة البكتيرية في قارورة جديدة تحتوي على 50 مل من مرق الصويا Tryptic ، واحتضان الثقافة ، في الخلاط ، عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة إضافية لتحقيق مرحلة السجل. في نهاية الحضانة الثانية ، انقل ملليلتر واحد من البكتيريا من الثقافة الثانية إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر للطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج اللوحة وأعد تعليق البكتيريا برفق في ملليلتر واحد من المحلول الملحي المعقم لثلاث غسلات منفصلة.

بعد الغسيل الثالث ، قم بتعليق البكتيريا في مليلتر آخر من محلول ملحي معقم ، وقم بإعداد تخفيفات متسلسلة من اللقاح. قم بقياس ملليلتر واحد من واحد إلى 10 وواحد إلى 100 مخفف في كوفيت يمكن التخلص منه ، في نسختين ، لتحديد OD600 من K.pneumoniae المغسول. OD600 من 1.0 يعادل تقريبا أربعة إلى سبعة أضعاف 10 إلى CFU الثامن في المليلتر.

بعد حساب تركيز البكتيريا في كل تخفيف ، قم بتعليق جرعة CFU المطلوبة في 50 إلى 60 ميكرولتر من محلول ملحي معقم لكل متلقي يبلغ من العمر ثمانية إلى 12 أسبوعا. لتوصيل البكتيريا إلى ، ارسم لقاح الجرعات في طرف ماصة P200 ، وضع الفأر المخدر في وضع ضعيف شبه راقد ، معلق بواسطة القواطع الفكية ، من شريط مطاطي ممتد بين أوتاد لوح زجاجي مائل. باستخدام زوج من الملقط غير الحاد وغير المموج ، اسحب اللسان برفق إلى الجانب وقم بإيداع الجرعة في تجويف فم مع الحرص على تجنب إحداث صدمة في اللسان أو البلعوم الفموي.

حافظ على سحب اللسان ، وقم بإغلاق الأنف برفق بإصبع مرتدي قفازا ، حتى يستنشق المنزل مرتين إلى ثلاث مرات. عندما لا يكون هناك سائل مرئي في تجويف الفم ، انقل الفأر من لوحة التلقيح إلى قفصها ، في وضع ضعيف ، لمنع انسداد الأنفاد أثناء تعافي الفأر. قم بعمل قطع طولي أسفل القص مباشرة.

ثم ، رفع القص بالملقط ، قم بتقطيع الحجاب الحاجز ، مما يسمح للرئة بالسقوط مرة أخرى في تجويف الصدر. استمر في الشق لأعلى من خلال تجويف الصدر على جانبي الأوعية الدموية وأعلى عبر الرقبة. عندما تكون القصبة الهوائية مرئية ، قم بقطع منتصف الرقبة بعناية وادفع الأنسجة إلى الجانبين لتجنب إتلاف الأوعية الدموية المحيطة.

الآن قم بتقطيع القصبة الهوائية بحوالي ربع الطريق من الرأس ، وأدخل قنية متصلة بحقنة سعة مليلتر واحد محملة مسبقا بملليلتر واحد من PBS في القصبة الهوائية. ادفع الحجم إلى الرئتين ببطء ، مما يسمح لجميع الفصوص بالانتفاخ. ثم اسحب الحجم للخارج مرة أخرى باستخدام المحقنة وقم بتجميع الغسالات المجمعة في أنبوب سعة 15 مليلتر ، على الثلج.

في نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، اجمع الدم من البطين الأيسر وانقله إلى أنبوب هيباريني لتجنب التخثر. ثم احصد كل فصوص الرئة في أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من PBS ، والطحال في أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على ملليلترين من PBS. بعد ذلك ، استخدم المجانسات الفردية التي تستخدم لمرة واحدة لكل عينة ، لنقع الأنسجة على الجليد ، متبوعا بالتخفيف التسلسلي لملاط الأنسجة.

ضع التخفيفات ، في نسختين ، على جوانب منفصلة من لوحة TSA واحدة ، واترك العينات تجف لفترة وجيزة. ثم اقلب الصفائح وقم بزراعة العينات في حاضنة ثابتة 37 درجة مئوية طوال الليل ، مع حساب متوسط المستعمرات البكتيرية من جانبي الصفيحة ومن كل تخفيف في صباح اليوم التالي. في 2000 CFU من K.pneumoniae, الفئران, عادة, تبدأ في إظهار الأعراض السريرية 12 إلى 24 ساعة بعد الإصابة.

في غضون 48 إلى 72 ساعة ، تظهر على العديد من أعراض المرض والمراضة التي يسبقها عادة فقدان الوزن بنسبة 20 في المائة في المتوسط. ومع ذلك ، تسمح جرعة LD50 باكتشاف كل من زيادة وانخفاض البقاء على قيد الحياة نسبيا داخل المجموعة التجريبية ، وقد تكون مفضلة للدراسات طويلة الأجل. تتميز عدوى الجهاز التنفسي السفلي ب K.pneumoniae بتدفق قوي للكريات البيض إلى مجرى الهواء في غضون ست ساعات من الإصابة ، والتي تبلغ ذروتها بمقدار 24 ساعة ويتم تمثيلها في الغالب بواسطة العدلات.

يمكن اكتشاف السيتوكينات في سائل غسل القصبات الهوائية في كل من 24 و 48 ساعة بعد الإصابة ب K.pneumoniae ، وتوفر نظرة ثاقبة على البيئة المكروية للرئة وتجنيدها الذاتي المناعي استجابة للغزو البكتيري. يزداد الحمل البكتيري في الرئة والدم والطحال أيضا بشكل كبير بين 24 و 48 ساعة من الإصابة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء طريقة الشفط الفموي البلعومي لعدوى الرئة في دقيقة إلى دقيقتين فقط لكل فأر إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم استخدام حجم الشفط المفرط. عادة ما يعمل الحجم من 50 إلى 60 ميكرولتر بشكل جيد مع الماوس الذي يتراوح عمره من ثمانية إلى 12 أسبوعا. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من الطرق على أنسجة الرئة والمحيطية للسماح بقياس الاستجابة المناعية في إزالة مسببات الأمراض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إحداث الالتهاب الرئوي الجرثومي التجريبي عن طريق توصيل مسببات الأمراض الفموية البلعومية وتحديد عبء العامل الممرض في الفئران. لا تنس أن العمل مع الميكروبات يمكن أن يكون خطيرا وأن الاحتياطات والممارسات الأساسية ل BSL-2 يجب دائما اتخاذ أثناء إجراء هذا الإجراء.