والطريقة غير الغازية ومن الناحية الفنية غير كثيفة للتحريض وPhenotyping التجريبية البكتيرية والالتهاب الرئوي في الفئران

الهدف العام من هذا البروتوكول التجريبي هو توفير إجراء غير باضع وغير مكثف تقنيًا لاستحثاث الالتهاب الرئوي البكتيري في الفئران، ومن ثم القياس الكمي لاستجابة الدفاع المضيف في الرئتين داخل الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات الأمراض المعدية وعلم المناعة، حول الجينات والمسارات الجزيئية التي تتحكم في استجابة المضيف للعدوى. وتتمثل الميزة الرئيسية لطريقة عدوى الرئة هذه في بساطتها التقنية.

وهذا يتيح حتى للمختبرات ذات الخبرة المحدودة في الإجراءات الرئوية دراسة الاستجابة المناعية الفطرية الرئوية. في منشأة من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية، قم بإذابة مخزون جليسرول من K.pneumoniae وانقل 1 mL من البكتيريا إلى دورق استنبات سعة 500 mL يحتوي على 50 mL من Tryptic Soy Broth. قم بحضن المزرعة المعلقة طوال الليل عند 37 °C وبسرعة 200 إلى 225 RPM.

في صباح اليوم التالي، يتم تخفيف من واحد إلى خمسة ملليلتر من المزرعة البكتيرية في دورق جديد يحتوي على 50 ملليلتر من Tryptic Soy Broth، وتُحضن المزرعة في الهزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة إضافية للوصول إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي. وفي نهاية فترة التحضين الثانية، يتم نقل ملليلتر واحد من البكتيريا من المزرعة الثانية إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر لإجراء عملية الطرد المركزي. ثم يُزال السائل الطافي دون المساس بالراسب، وتُعاد معلقات البكتيريا برفق في ملليلتر واحد من المحلول الملحي المعقم لثلاث غسلات منفصلة.

بعد الغسلة الثالثة، أعد تعليق البكتيريا في ملليلتر آخر من المحلول الملحي المعقم، وقم بإعداد تخفيفات تسلسلية لوغاريتمية لللقاح. قم بقياس ملليلتر واحد من التخفيفات بنسبة 1 إلى 10 و1 إلى 100 في كيوفات (cuvettes) مخصصة للاستخدام مرة واحدة، وذلك بشكل مكرر، لتحديد OD600 لبكتيريا K.pneumoniae المغسولة. تعادل قيمة OD600 البالغة 1.0 تقريبًا ما بين أربعة إلى سبعة مضروبة في 10⁸ CFU لكل ملليلتر.

بعد حساب تركيز البكتيريا في كل تخفيف، أعد تعليق جرعة وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) المطلوبة في 50 إلى 60 µL من المحلول الملحي المعقم لكل حيوان مستقبل يتراوح عمره بين 8 و12 أسبوعاً. ولإيصال البكتيريا إلى الحيوانات، اسحب اللقاح المخصص للجرعة في رأس ماصة P200، وضع الفأر المخدر في وضعية استلقاء ظهري شبه مائلة، بحيث يكون معلقاً من القواطع العلوية بواسطة شريط مطاطي ممدد بين مسامير لوحة Plexiglas مائلة. وباستخدام ملقط غير مسنن وغير حاد، اسحب اللسان برفق إلى الجانب وضع الجرعة في تجويف الفم للحيوان، مع الحرص على تجنب التسبب في أي إصابة للسان أو البلعوم الفموي.

مع إبقاء اللسان متراجعًا، قم بسد الأنف برفق باستخدام إصبع يرتدي قفازًا، حتى يستنشق الفأر مرتين أو ثلاث مرات. وعندما لا يظهر أي سائل في التجويف الفموي، انقل الفأر من لوحة التلقيح إلى قفصه في وضع الاستلقاء على الظهر، لمنع انسداد المنخرين أثناء تعافي الفأر. قم بإجراء قطع طولي أسفل القص مباشرة.

بعد ذلك، ارفع عظمة القص باستخدام ملقط، ثم اصنع شقاً في الحجاب الحاجز، مما يسمح للرئة بالعودة إلى تجويف الصدر. واصل إجراء الشق صعوداً عبر تجويف الصدر على جانبي الأوعية الدموية وصولاً إلى الرقبة. وعندما تصبح القصبة الهوائية مرئية، اقطع بحذر في منتصف الرقبة وادفع الأنسجة إلى الجوانب لتجنب إتلاف الأوعية الدموية المحيطة.

الآن، قم بعمل شق في القصبة الهوائية على بعد حوالي ربع المسافة نزولاً من الرأس، وأدخل في القصبة الهوائية، في الاتجاه الذيلي، كانيولا متصلة بسرنجة سعة 1 milliliter محملة مسبقاً بـ 1 milliliter من PBS. ادفع الحجم إلى الرئتين ببطء، مما يسمح بانتفاخ جميع الفصوص. ثم اسحب الحجم مرة أخرى باستخدام السرنجة واجمع الغسولات التي تم الحصول عليها في أنبوب سعة 15 milliliter، على الثلج.

عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، يتم جمع الدم من البطين الأيسر ونقله إلى أنبوب يحتوي على الهيبارين لتجنب التجلط. بعد ذلك، يتم استئصال جميع فصوص الرئة في أنبوب سعة 15 milliliter يحتوي على خمسة milliliters من PBS، والطحال في أنبوب سعة 15 milliliter يحتوي على اثنين milliliters من PBS. ثم تُستخدم أجهزة تجانس فردية ذات استخدام واحد لكل عينة، لطحن الأنسجة على الثلج، يليه التخفيف المتسلسل لمعلقات الأنسجة.

قم بتوزيع التخفيفات، في مكررات، على جوانب منفصلة من طبق TSA واحد، واترك العينات تجف لفترة وجيزة. بعد ذلك، اقلب الأطباق وازرع العينات في حاضنة ساكنة عند 37 degrees Celsius طوال الليل، مع حساب متوسط المستعمرات البكتيرية من كلا جانبي الطبق ومن كل تخفيف في صباح اليوم التالي. عند 2000 CFU من *K.pneumoniae*، تبدأ الفئران عادةً في إظهار الأعراض السريرية خلال 12 إلى 24 ساعة بعد العدوى.

في غضون 48 إلى 72 ساعة، تظهر على العديد من الحيوانات أعراض المرض والمراضة، والتي تسبقها عادةً خسارة في الوزن بنسبة متوسطها 20 بالمئة. ومع ذلك، تتيح جرعة LD50 الكشف عن كل من الزيادة والنقصان النسبي في معدلات البقاء على قيد الحياة داخل المجموعة التجريبية، وقد تكون مفضلة للدراسات طويلة المدى. وتتميز عدوى الجهاز التنفسي السفلي بـ K.pneumoniae بتدفق قوي للخلايا البيضاء إلى الممرات الهوائية خلال ست ساعات من العدوى، ويصل هذا التدفق إلى ذروته بحلول 24 ساعة وتتمثل غالطبيعة في الخلايا المتعادلة.

يمكن الكشف عن السيتوكينات في سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية بعد 24 و48 ساعة من الإصابة ببكتيريا K.pneumoniae، وهي توفر رؤية حول البيئة الدقيقة للرئة واستجابتها المناعية ذاتياً في مواجهة الغزو البكتيري. كما تزداد الحمل البكتيري في الرئة والدم والطحال بشكل كبير بين 24 و48 ساعة من الإصابة. وبمجرد إتقان طريقة السحب الفموي البلعومي لإحداث عدوى الرئة، يمكن تنفيذها في غضون دقيقة إلى دقيقتين فقط لكل فأر إذا تم تطبيقها بشكل صحيح.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم استخدام حجم شفط مفرط. وعادةً ما يكون الحجم من 50 إلى 60 µL مناسباً لفأر يتراوح عمره بين 8 و12 أسبوعاً. وبعد هذا الإجراء، يمكن تطبيق مجموعة متنوعة من الطرق على الرئة والأنسجة الطرفية للسماح بقياس الاستجابة المناعية في عملية التخلص من المسببات المرضية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تحفيز الالتهاب الرئوي البكتيري التجريبي عبر إيصال الممرض عن طريق البلعوم الفموي، وكيفية تحديد العبء الممرض في الفئران. لا تنسَ أن العمل مع الميكروبات قد يكون خطيراً، وأنه يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات والممارسات الأساسية لمستوى السلامة البيولوجية الثاني BSL-2 أثناء تنفيذ هذا الإجراء.