منهجيات لدراسة B. الرقيقة الأغشية الحيوية نموذجا للتميز الصغيرة جزيء بيوفيلم المانعون

تعتبر الأغشية الحيوية البكتيرية مهمة لصحة الإنسان ، وتحمي سكانها البكتيريين من الإهانات البيئية والعوامل المضادة للميكروبات. كان الهدف من هذا الإجراء هو تطوير نظام نموذجي لتقييم تأثيرات مثبطات الجزيئات الصغيرة على تكوين الأغشية الحيوية. يمكن أن تساعد هذه الطرق في إنشاء مجموعة أدوات ضرورية لمجال الأغشية الحيوية لاختيار مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف تكوين الأغشية الحيوية على وجه التحديد.

الميزة الرئيسية لهذه المنهجيات هي أنها تبدأ من إطار تجريبي متسق وقوي ، وتعطي رؤى كمية ونوعية حول آلية عمل مثبطات الأغشية الحيوية. على الرغم من أن هذه الطرق يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للأغشية الحيوية Bacillus subtilis ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على البكتيريا الأخرى المكونة للأغشية الحيوية ، مثل Pseudomonas aeruginosa أو العامل الممرض النباتي Xanthomonas citri. يمكن أن يكون الفحص المجهري الإلكتروني ضروريا لتحليل تأثير الجزيئات الصغيرة على تكوين الأغشية الحيوية ، لأنه يسمح بمراقبة المصفوفة خارج الخلية ، ويعطي دقة خلية واحدة.

للبدء ، حدد أولا مستعمرة واحدة مناسبة ، وانقلها إلى ثلاثة ملليلتر من مرق LB. ضع ثقافة البادئ هذه في حاضنة اهتزاز لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، خذ 1.5 مل من ثقافة البادئ ، وجهاز الطرد المركزي لمدة أربع دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، ثم أعد تعليق الحبيبات في 1.5 مل من وسط MSgg. لزراعة البليلات ، قم بإعداد صفيحة زراعة خلية مكونة من 12 بئرا عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر من MSgg إلى كل بئر. إلى بعض هذه الآبار ، أضف MSgg مع مثبط جزيء صغير في نطاق تركيز ، مع توزيع موقع تركيزات مختلفة حول الطبق ، لتجنب تأثيرات الحافة.

قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر من ثقافة البداية المعاد تعليقها. يجب أن تكون الثقافة بين 0.6 و واحد. هذا أمر بالغ الأهمية لمتانة النظام.

قم بتلميع كل بئر من لوحة الثقافة ب 3 ميكرولترات من ثقافة البداية المعاد تعليقها. ثم احتضان اللوحة عند 23 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام في ظل ظروف ثابتة. بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ، وراقب البجولات.

لزراعة الأغشية الحيوية ، استخدم قالبا وحدد بشكل متماثل أربع قطرات منفصلة من 1.5 ميكرولتر من مزرعة البداية غير المغسولة على لوحة Agar MSgg المجففة 8.5 سم 1.5٪. دع القطرات تمتص في الوسط قبل تحريك اللوحة. احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.

باستخدام مجهر مع تعرض متجانس للإضاءة ، تحقق من أن مستعمرات الأغشية الحيوية قد تطورت وشكلت بنية مجعدة ثلاثية الأبعاد. أولا ، خذ شفرة حلاقة نظيفة وقم بتقطيع مستعمرات الأغشية الحيوية إلى قسمين متساويين بمساعدة القالب. ارفع نصف المستعمرة بعناية باستخدام ملعقة نظيفة ، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، يحتوي على 500 ميكرولتر من PBS.

خذ النصف الثاني من المستعمرة ، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 500 ميكرولتر من 50٪ من الإيثانول. سيتم استخدامها لتقييم مقاومة عوامل التعقيم. بعد ذلك ، خذ بالمثل النصف الأول من مستعمرة D-lysine المعالجة ، وضعها في PBS.

ثم خذ النصف الثاني من هذه المستعمرة ، وانقله إلى الإيثانول. احتضان جميع الأنابيب التي تحتوي على أنصاف الأغشية الحيوية لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 18 ، 000 مرة جم.

باستخدام ماصة ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية. أضف 300 ميكرولتر من PBS ، ثم صوتنة الخلايا في إعداد منخفض ، باستخدام سونيكاتور ميكروتيب. أضف 700 ميكرولتر إضافي من PBS للحصول على حجم نهائي يبلغ مليلتر واحد.

بعد ذلك ، قم بإجراء تخفيف تسلسلي من 10 إلى سالب سبعة في PBS. خذ 100 ميكرولتر من أحد التخفيفات ، وقم بتلقيح لوحة Agar LB بنسبة 1.5٪. كرر هذه الخطوة لمخففين آخرين لكل عينة.

انشر innoculum باستخدام الخرز الزجاجي ، ثم احتضن الألواح طوال الليل عند 30 درجة مئوية. افحص اللوحات واحسب وحدات تشكيل المستعمرة ، أو CFU. بعد حساب قيمة CFU لكل مليلتر ، احسب النسبة المئوية للناجين في PBS مقابل علاجات الإيثانول.

لبدء تثبيت العينة ، قم أولا بإعداد محلول مثبت جديد كاف للعدد المطلوب من مستعمرات الأغشية الحيوية. أضف بعناية خمسة ملليلتر من المثبت لكل طبق بتري ، وتجنب سحب العينات مباشرة على المستعمرات. ستبدأ المستعمرات في الانفصال عن أجار وتطفو.

أغلق الألواح بعناية باستخدام البارافيلم ، واحتضن على شاكر دوار لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. انقل الأطباق إلى أربع درجات مئوية للتخزين طوال الليل. قم بإزالة السائل المثبت برفق باستخدام ماصة باستور متصلة بالمكنسة الكهربائية.

أضف 10 ملليلتر من 100 نانومولار من كاكوديلات الصوديوم ، وخمسة مللي مولار من كلوريد الكالسيوم لغسل الأغشية الحيوية ، واحتضانها لمدة خمس دقائق. افصل بعناية مركز مستعمرة الأغشية الحيوية عن صفيحة أجار باستخدام ماصة باستور. لتجفيف المستعمرات في الهواء ، قم بتقطيع ورق ترشيح السليلوز إلى أرباع ، ثم اغمر قسما واحدا في 100٪ من الإيثانول.

انقل بعناية مستعمرة غشاء حيوي عائمة واحدة على الورق. ضع الورق في طبق بتري مبطن بورق ترشيح جاف. ثم غطي الطبق واتركيه في غطاء كيميائي حتى يجف طوال الليل.

من أجل الحفاظ على مورفولوجيا مستعمرة الأغشية الحيوية ، من المهم وضع أساس الأغشية الحيوية العائمة بالكامل باستخدام ورق السليلوز. بمجرد وضعه على الورق ، لا يمكن إعادة ضبط الأغشية الحيوية. قم بتغطية كعب المجهر الإلكتروني بشريط كربوني ، ثم استخدم الملقط لنقل مستعمرات الأغشية الحيوية بعناية إلى كعب الروتين.

بعد توصيل كل مستعمرة بكعب الروتين ، عن طريق إضافة جسر رفيع من شريط الكربون ، قم بتخزين البذرة في مجفف لمدة 24 ساعة أو حتى الحاجة. تتطلب هذه الخطوة يدا ثابتة ودقيقة ، لأن الأغشية الحيوية في هذه المرحلة هشة للغاية ويمكن كسرها بسهولة. التحدي هو تركيب جزء كبير من الأغشية الحيوية دون تشققات.

في يوم الفحص ، ضع المستعمرات في مغطي الرش الذهبي والبلاديوم. قم بتغطية العينات لمدة دقيقتين بزاوية 60 درجة. كرر هذه الخطوة مرتين ، مع تدوير العينات 120 درجة بينهما.

أخيرا ، قم بتغطية العينات مرة واحدة لمدة ثلاث دقائق من الأعلى. العينات جاهزة الآن للتصوير على SEM. تظهر هذه الصور التكوين الحجري ل B.subtilis المزروع في وسط MSgg المحفز للأغشية الحيوية.

مع إضافة مثبط الجزيء الصغير D-lysine ، يتم تقليل تطور pellicle. ومع زيادة تركيز المثبط ، يظهر تكوين البللي انخفاضا مرتبطا. يوضح هذا الرسم البياني تأثير التعرض للإيثانول على بقاء الخلايا داخل مستعمرات الأغشية الحيوية ، أو المعالجة بمثبط D-lysine ، أو تركها دون علاج.

أظهرت المستعمرات المعالجة ب D-lysine ، وتعرضت ل 50٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق ، انخفاضا كبيرا في البقاء على قيد الحياة مقارنة بالجزء غير المعالج. تظهر الصور المجهرية من أعلى إلى أسفل أن المستعمرات التي نمت في وجود D-lysine كانت أصغر بشكل عام ، وشكلت تجاعيد أقل وضوحا من تلك التي تركت دون علاج. تكشف صور المجهر الإلكتروني الماسح لمستعمرات الأغشية الحيوية المجففة ذات النقطة الحرجة عن تطور الأغشية الحيوية المتغيرة.

ظهرت مصفوفة المواد البوليمرية خارج الخلية ، أو EPS ، أشبه بشبكة العنكبوت في العينات غير المعالجة ، حيث أظهرت العينات المعالجة تنظيما أقل. أخيرا ، يظهر الفحص عند دقة الخلايا البكتيرية الفردية أن الخلايا المعالجة ممدودة في المظهر ، وأقل تغطية ب EPS ، وليست مرتبطة بإحكام بجيرانها مثل الخلايا غير المعالجة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن وضع إطار عمل ثابت لدراسة مثبطات الأغشية الحيوية أمر ضروري للحصول على نتائج قابلة للتكرار.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء فحص جزيء صغير لتثبيط الأغشية الحيوية في أقل من أسبوع إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التحقيق في التعبير الجيني في خلايا الأغشية الحيوية المفردة ، من أجل الحصول على رؤى إضافية حول هدف مثبط الجزيء الصغير. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل التأثير الكلي لمثبطات الأغشية الحيوية المحددة على نمو الأغشية الحيوية ومقاومة المضادات الحيوية.