Name: منهجيات لدراسة B. الرقيقة الأغشية الحيوية نموذجا للتميز الصغيرة جزيء بيوفيلم المانعون (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: اكتشف منهجيات قابلة للتكرار لدراسة مثبطات الأغشية الحيوية وتأثيراتها على تعددية خلايا Bacillus subtilis. توفر هذه الطرق رؤى كمية ونوعية حول آليات عمل المثبطات المستهدفة للأغشية الحيوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم إجراء التصوير المجهري الإلكتروني في وحدة المجهر الإلكتروني في معهد وايزمان للعلوم ، بدعم جزئي من مركز إيرفينغ وتشيرنا موسكوفيتز للتصوير بالنانو والنانو الحيوي. تم دعم هذا البحث أيضا من قبل منحة ISF I-CORE 152/1 ، السيد والسيدة دان كين ، السيدة لويس روزين ، من خلال منحة بحثية من Yeda-Sela ، من مؤسسة لارسون الخيرية ، من قبل برنامج علماء روث وهيرمان ألبرت للعلماء الجدد ، من قبل معهد إلسي كاتز لعلوم المواد ومنحة أبحاث الرنين المغناطيسي ، من قبل منحة وزارة الصحة لطرق البحث البديلة ، ومن قبل برنامج أبحاث فرنسا إسرائيل - موسى بن ميمون - إسرائيل. IKG حاصلة على كرسي التطوير الوظيفي في رولاند وسيلفيا.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

العصوية الرقيقة أشكال قوية ومنظم للغاية الأغشية الحيوية في كل من السائل (pellicles) وعلى وسط صلب (المستعمرات). وبالتالي، فإنه بمثابة كائن نموذجا مثاليا لوصف طريقة عمل مثبطات بيوفيلم محددة. على وسائل الاعلام الصلبة، الخلايا تشكل هياكل متعددة الخلايا مع السمات المميزة التي ليست واضحة في pellicles، مثل التجاعيد يشع من المركز إلى الحافة. وهكذا، pellicles والمستعمرات هي أنظمة تكميلية لدراسة B. الرقيقة multicellularity. <p class="jove_content" style=";text-align:ri...

المجتمعات البكتيرية متعددة الخلايا تلعب أدوارا هامة في البيئات الطبيعية والبشرية، ويمكن أن تكون مفيدة أو ضارة للغاية. ومن المعروف أن هذه المستعمرات متعددة الخلايا كما الأغشية الحيوية، حيث يتم تضمين الخلايا الفردية في المواد البوليمرية خارج الخلية الذات المنتجة (EPS) المصفوفة. العائد على السهم تلتزم بقوة الخلايا على سطح أنها استعمار. أنها بمثابة درع ضد القوات الميكانيكية والكيميائية وإنشاء اتصال وثيق بين الخلايا المجاورة، وتسهيل الاتصالات الخلوية 1. يمكن مشاهدة بيوفيلم كمجتمع متباينة، حيث تستخدم الخلايا درجة عالية من التنظيم، منسقة عمليات لتنسيق أنشطتها داخل المجتمع، وكذلك عبر الأنواع 2-5. وكثيرا ما يرتبط الانتقال من العوالق، ووضع حرة المعيشة للنمو إلى حالة بيوفيلم مع العمليات التنموية. وخير مثال هو بكتيريا التربة العصوية الرقيقة موجبة الجرام، وبالتالي على undomeيخدم سلالة sticated كما كائن نموذج قوي لدراسة مراحل النمو مما يؤدي إلى تشكيل بيوفيلم. في هذه البكتيريا وخلايا متحركة تنظيم أنفسهم في هياكل متعددة الخلايا واضح لتنفيذ مهام متخصصة 4. مجموعة واحدة من الخلايا، المنتجين مصفوفة تفرز exopolysaccharides 6، بروتين اميلويد الطاسه 7،8، والبروتين للا مائية سطح BslA 9،10. وكلها مشاركة في الجمعية العامة للEPS 11-13. وبالنظر إلى وفرة من الأغشية الحيوية في المنافذ الطبيعية والبشرية والضرر القاتل المفترض أنها يمكن أن تسبب، هناك حاجة ملحة لايجاد سبل لمنع تكونها. يمكن مثبطات جزيء صغير مساعدة في اكتشاف مسارات تنظيمية جديدة، والانزيمات والبروتينات الهيكلية تشارك في تشكيل بيوفيلم، وبالتالي تعزيز الرؤى في العمليات المعقدة التجمع مجتمع متعدد الخلايا. كما B. الرقيقة هو نموذج المدروس لالحيويتشكيل الفيلم 14،15، ويمكن استخدامه لتقييم آثار مختلف مثبطات بيوفيلم. تتناول هذه الدراسة أربعة أساليب الأساسية التي هي مفتاح لتقييم استجابة من الأغشية الحيوية لمثبطات جزيء صغير. أولا، للتأكد من أن هذه المثبطات لديها هدف محدد بيوفيلم، والفصل بين تأثير على نمو العوالق من التأثير على تشكيل بيوفيلم أمر بالغ الأهمية. معظم وكلاء المضادة للبكتيريا تستهدف الخلايا في مرحلة النمو العوالق، ولكن الجزيئات التي تستهدف حياة بيوفيلم نادرة. بالإضافة إلى ذلك، كما الجزيئات التي لا تؤثر على نمو العوالق ليست سامة، يمكن أن تقلل من الضغط الانتقائي لصالح المسوخ المقاومة للمضادات الحيوية 16. على سبيل المثال، عندما يتم التعامل مع الأغشية الحيوية مع الأحماض الأمينية-D أو بعض الجزيئات الأخرى خلية التدخل الجدار، إما بالانزعاج هم أو تفكيكها، ولكن هذه المثبطات فقط تؤثر أقل ما يقال 12،17 نمو العوالق. في المقابل، العديد من المضادات الحيوية يضعف بشكل كبير نمو العوالق، مع لإيتل أو أي تأثير على تشكيل بيوفيلم 17. ثانيا، وضع إطار تجريبي ثابت وقوي لدراسة تأثير الجزيئات الصغيرة أمر بالغ الأهمية. لاحظنا أن نطاق تركيز نشط من مثبطات جزيء صغير حساس للشروط مسبقة الثقافة والإعداد التجريبية المستخدمة لدراسة تأثير هذه المثبطات جزيء صغير. تقارير مختلفة، لا سيما أولئك الذين يدرسون B. الرقيقة، وكشف الاختلافات في مدى التركيز الذي الأحماض الأمينية-D تمنع تشكيل pellicles - العائمة الأغشية الحيوية البكتيرية 12،17-19. وتشير النتائج المعروضة هنا أن العوامل التالية تمثل اختلافات في مدى تركيز نشاط: من شروط مسبقة ثقافة (لوغاريتمي 12،17 مقابل مرحلة نمو 20 في وقت متأخر من ثابتة)، ومتوسط النمو المستخدمة في حالة ما قبل الثقافة (الأغنياء، غير معروف [لوريا مرق، LB] مقابل يعرف [الغلوتامات أحادية الصوديوم-glycerol، MSgg])، ونسبة التلقيح وخصوصا إزالة المتوسطة قبل الثقافة قبل التلقيح. وأظهرت درجة حرارة النمو جليدة ثابت دورا أقل أهمية في نطاق نشاط صغير جزيء المانع D-ليسين، وهو حمض تمثيلي-D الأمينية المستخدمة في هذه الدراسة. وأخيرا، مرة واحدة يتم التعامل مع الأغشية الحيوية مع مثبطات بيوفيلم محددة، يطلب من وسائل قوية ومفيدة لوصف آثار هذه المثبطات على اللياقة البدنية بيوفيلم. هنا، يتم وصف طريقتين لوصف مستقل تأثير مثبطات جزيء صغير بالتفصيل: (1) تأثير على الخلايا وحيدة داخل مستعمرة بيوفيلم ومقاومتها للمضادات الحيوية. الخلايا في الأغشية الحيوية تكون في العادة أكثر مقاومة للمضادات الحيوية بالمقارنة مع البكتيريا التي تعيش خالية من 21-23. رغم أن هذه الظاهرة هي سياقاتها، وغالبا ما تعتبر قدرة EPS للحد من تغلغل المضادات الحيوية كتفسير جذابة 24 </suص&gt;. هذه الطريقة يقيم بقاء خلايا بيوفيلم محددة سلفا بعد التعرض للمواد مضادة للجراثيم. (2) أثر على بنية مستعمرة بيوفيلم، من كبيرة إلى صغيرة الحجم. تتميز المستعمرات بيوفيلم بواسطة هيكلها ثلاثي الأبعاد وجود EPS. باستخدام المجهر الإلكتروني، والتغييرات في شكل الخلية، بنية مستعمرة بيوفيلم والهندسة المعمارية وفرة من EPS يمكن تصور من كبير (ملم) على نطاق صغير (ميكرون).

<table><tbody><tr><td>مرق لوريا ، لينوكس</td><td>ديفكو</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>باكتو أجار</td><td>ديفكو</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة &nbsp ؛</td><td>سيجما ، 136.09 جم / مول</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم ثنائي الأساس &nbsp ؛</td><td>فيشر العلمي ، 174.18 جم / مول</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>3- (N-morpholino) حمض البروبان سلفونيك</td><td>فيشر العلمي ، 209.27 جم / مول</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم &nbsp ؛</td><td>ميرك ، 203.30 جم / مول &nbsp ؛</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم اللامائي</td><td>جي تي بيكر ، 110.98 جم / مول</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المنغنيز (II) رباعي هيدرات</td><td>سيجما ، 197.91 جم / مول</td><td>31422-250G-R</td><td></td></tr><tr><td>سداسي هيدرات كلوريد الحديد (III) &nbsp ؛</td><td>سيجما ، 270.30 جم / شهر)</td><td>F2877-500G</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الزنك اللامائي &nbsp;</td><td>أكروس أورجانيكس ، 136.29 جم / مول</td><td>424592500</td><td></td></tr><tr><td>ثيامين هيدروكلوريد</td><td>سيجما ، 337.27 جم / مول</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptophan</td><td>Fisher Scientific ، 204.1 جم / مول</td><td>BP395-100</td><td></td></tr><tr><td>L-phenylalanine</td><td>Sigma ، 165.19 جم / مول</td><td>P5482-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>Sigma ، 119.12 جم / مول</td><td>T8625-100G</td><td></td></tr><tr><td>الجلسرين اللامائي</td><td>Bio-Lab Itd</td><td>712022300</td><td></td></tr><tr><td>أملاح حمض الجلوتاميك أحادية الصوديوم هيدرات &nbsp;</td><td>سيجما ، 169.11 جم / مول</td><td>G1626-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-leucine</td><td>Sigma ، 169.11 جم / مول</td><td>855448-10G</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول اللامائي</td><td>Gadot</td><td>شفرة الحلاقة 830000054</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eddison</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>أوراق ترشيح السليلوز الدائرية</td><td>Whatman ، 90 مم</td><td>1001-090</td><td></td></tr><tr><td>جلوتارالديهايد</td><td>EMS (علم التنظير المجهري الإلكتروني) ، 25٪ في الماء</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهايد &nbsp;</td><td>EMS ، 16٪ في الماء</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>كاكوديلات الصوديوم</td><td>ميرك ، 214.05 جم / مول &nbsp ؛</td><td>8.2067</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم 2-هيدرات</td><td>ميرك ، 147.02 جم / مول &nbsp ؛</td><td>1172113</td><td></td></tr><tr><td>كعب الألومنيوم جبل</td><td>EMS ، رأس مشقوق</td><td>75230</td><td></td></tr><tr><td>شريط لاصق كربوني</td><td>EMS</td><td>77825-12</td><td></td></tr><tr><td>شاكر 37 درجة ؛ C</td><td>New Brunswick Scientific Innowa42</td><td>NA</td><td></td></tr> جهاز <tr><td>طرد مركزي</td><td>Eppendorf جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة 5424</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Digital Sonifier ، موديل 250 ، يستخدم مع Double Step Microtip</td><td>Branson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 30 & deg ؛ C</td><td>Binder</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>حاضنة 23 درجة ؛ نظام</td> فلتر سي <td>بيندر</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>، 500 مل ، البوليسترين</td><td>كورنيج إنكوربوريتد</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>شاكر روتاري - أوربيترون دوار II</td><td>Boekel</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>S150 Sputter Coater&nbsp;</td>مجفف النقطة <td>الحرجة Edwards</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030</td><td>BAL-TEC</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>مجهر إلكتروني للمسح البيئي</td><td>XL30 ESEM FEG Philips (FEI)</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

منهجيات لدراسة<em&gt; b. الرقيقة</em&gt; الأغشية الحيوية نموذجا للتميز الصغيرة جزيء بيوفيلم المانعون

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

يقيم هذا العمل منهجيات مختلفة لدراسة تأثير مثبطات الأغشية الحيوية للجزيئات الصغيرة ، مثل الأحماض الأمينية D ، على تطوير ومرونة الأغشية الحيوية Bacillus subtilis. أولا ، يتم تقديم طرق تختار مثبطات الجزيئات الصغيرة ذات الأهداف الخاصة بالغشاء الحيوي من أجل فصل تأثير مثبطات الجزيئات الصغيرة على نمو العوالق عن تأثيرها على تكوين الأغشية الحيوية. بعد ذلك ، نركز على كيفية تأثير ظروف التلقيح على حساسية مزارع B. subtilis متعددة الخلايا العائمة لمثبطات الجزيئات الصغيرة. تشير النتائج إلى أن التناقضات في التأثيرات المبلغ عنها لمثل هذه المثبطات مثل الأحماض الأمينية D ترجع إلى ظروف ما قبل الاستزراع غير المتسقة. علاوة على ذلك ، تم وصف بروتوكول تم تطويره مؤخرا لتقييم مساهمة علاجات الجزيئات الصغيرة في مقاومة الأغشية الحيوية للمواد المضادة للبكتيريا. أخيرا ، يتم تقديم تقنيات المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لتحليل الترتيب المكاني ثلاثي الأبعاد للخلايا والمصفوفة خارج الخلية المحيطة بها في B. subtilis الأغشية الحيوية. يسهل SEM نظرة ثاقبة لبنية الأغشية الحيوية ثلاثية الأبعاد ونسيج المصفوفة. يمكن أن تساعد مجموعة من الأساليب الموضحة هنا بشكل كبير في دراسة تطور الأغشية الحيوية في وجود وعدم وجود مثبطات الأغشية الحيوية ، وإلقاء الضوء على آلية عمل هذه المثبطات.

فحص جليدة هو أسلوب واحد لدراسة العمليات درجة عالية من التنظيم والحيوية من B. الرقيقة multicellularity. وبالاضافة الى هذا، هي مناسبة لفحص جليدة لاختبار مجموعة وإما شروط مسبقة بداية أو تركيزات جزيء صغير في لوحة multidish واحدة لزراعة الخلايا في تجربة واحدة. ومع ذلك، B. الرقيقة تشكيل جليدة حساسة للشروط مسبقة الثقافة (على سبيل المثال، متوسط النمو لما قبل الثقافة ومرحلة نموها)، ونسبة التلقيح وإزالة المتوسط قبل الثقافة. وبالتالي فإننا فحص أولا للحصول على الإعد...

تقدم هذه الدراسة تطوير منهجيات قابلة للتكرار لدراسة مثبطات الأغشية الحيوية وتأثيراتها على تعدد الخلايا Bacillus subtilis.

منهجيات لدراسة<em&gt; B. الرقيقة</em&gt; الأغشية الحيوية نموذجا للتميز الصغيرة جزيء بيوفيلم المانعون

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

تعد الأغشية الحيوية البكتيرية ذات أهمية بالغة لصحة الإنسان، حيث توفر الحماية للبكتيريا المستوطرة فيها من المؤثرات البيئية والعوامل المضادة للميكروبات. كان الهدف من هذا الإجراء هو تطوير نظام نموذجي لتقييم آثار المثبطات الجزيئية الصغيرة على تكوين الغشاء الحيوي. ويمكن لهذه الطرق أن تساعد في إنشاء مجموعة أدوات أساسية في مجال الأغشية الحيوية لاختيار المثبطات الجزيئية الصغيرة التي تستهدف تحديداً عملية تكوين الغشاء الحيوي.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه المنهجيات في أنها تنطلق من إطار تجريبي متسق وقوي، وتقدم رؤى كمية ونوعية حول آلية عمل المثبطات النوعية للغشاء الحيوي الرقيق. ورغم أن هذه الطرق يمكن أن توفر رؤى حول الأغشية الحيوية لبكتيريا Bacillus subtilis، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنواع أخرى من البكتيريا المكونة للأغشية الحيوية، مثل Pseudomonas aeruginosa أو الممرض النباتي Xanthomonas citri. كما يمكن أن يكون المجهر الإلكتروني الماسح ضرورياً لتحليل تأثير الجزيئات الصغيرة على تكوين الغشاء الحيوي، لأنه يسمح بمراقبة المادة الخلالية خارج الخلوية، ويوفر دقة تحليلية على مستوى الخلية الواحدة.للبدء، اختر أولاً مستعمرة مفردة مناسبة، وانقلها إلى 3 mL من مرق LB. ضع هذا المزرعة البادئة في حاضنة هزازة لمدة أربع ساعات عند 37 °C. بعد الحضن، خذ 1.5 mL من المزرعة البادئة، وقم بإجراء عملية الطرد المركزي لمدة أربع دقائق.قم بإزالة السائل الطافي بعناية، ثم أعد تعليق الراسب في 1.5 milliliters من وسط MSgg. ولتنمية الأغشية الحيوية، جهز طبق زراعة خلايا مكون من 12 بئراً بإضافة ثلاثة milliliters من MSgg إلى كل بئر. أضف إلى بعض هذه الآبار وسط MSgg مع مثبط جزيئي صغير ضمن نطاق تركيزات محدد، مع توزيع مواقع التركيزات المختلفة حول الطبق لتجنب تأثيرات الحواف.قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر للمستنبت البادئ المعاد تعليقه. يجب أن تتراوح قيمة المستنبت بين 0.6 و1. وهذا أمر بالغ الأهمية لضمان قوة النظام.قم بتلقيح كل بئر من أطباق المزرعة بـ 3 µL من المزرعة البادئة المعاد تعليقها. ثم، حضّن الطبق عند 23 °C لمدة ثلاثة أيام في ظروف سكون. بعد ذلك، أخرج الطبق من الحاضنة، وافحص الغشاء الحيوي (pellicles).لتنمية الأغشية الحيوية، استخدم قالباً وقم بتنقيط أربع قطرات منفصلة وبشكل متماثل، بحجم 1.5 µL من المزرعة البادئة غير المغسولة، على طبق MSgg يحتوي على Agar بنسبة 1.5% وجاف وبقطر 8.5 cm. اترك القطرات لتمتص في الوسط قبل تحريك الطبق. حضن الأطباق عند درجة حرارة 30 °C لمدة ثلاثة أيام.باستخدام مجهر ثنائي العينية مع تعريض متجانس للإضاءة، تحقق من نمو مستعمرات الغشاء الحيوي وتكوينها لبنية مجعدة ثلاثية الأبعاد. أولاً، استخدم شفرة حلاقة نظيفة لقطع مستعمرات الغشاء الحيوي إلى جزأين متساويين بمساعدة القالب. ارفع نصف المستعمرة بعناية باستخدام ملعقة مختبرية (spatula) نظيفة، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter، يحتوي على 500 µL من PBS.خذ النصف الثاني من المستعمرة، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 500 microliters من 50%ethanol. ستُستخدم هذه العينات لتقييم المقاومة لعوامل التعقيم. بعد ذلك، وبطريقة مماثلة، خذ النصف الأول من المستعمرة المعالجة بـ D-lysine، وضعه في PBS.بعد ذلك، خذ النصف الثاني من هذه المستعمرة، وانقله إلى الإيثانول. حضّن جميع الأنابيب التي تحتوي على أنصاف الغشاء الحيوي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ومن ثم، قم بطردها مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 18,000 ×g.باستخدام ماصة، قم بإزالة السائل الطافي بعناية. أضف 300 µL من PBS، ثم قم بمعالجة الخلايا بالموجات فوق الصوتية عند إعداد منخفض، باستخدام جهاز سونيكيتور ذو رأس مجهري. أضف 700 µL إضافية من PBS للوصول إلى حجم نهائي قدره 1 mL.بعد ذلك، قم بإجراء تخفيف تسلسلي بنسبة 10⁻⁷ في محلول PBS. خذ 100 µL من أحد التخفيفات، وقم بتلقيح طبق Agar LB بتركيز 1.5%. كرر هذه الخطوة لتخفيفين آخرين لكل عينة.قم بتوزيع اللقاح باستخدام خرزات زجاجية، ثم حضن الأطباق طوال الليل عند 30 درجة مئوية. افحص الأطباق وقم بعدّ الوحدات المكونة للمستعمرات، أو CFU. بعد حساب قيمة CFU لكل ملليلتر، احسب النسبة المئوية للناجين في معاملات PBS مقابل الإيثانول.لبدء تثبيت العينة، قم أولاً بتحضير كمية كافية من محلول التثبيت الطازج لعدد مستعمرات الغشاء الحيوي المطلوب. أضف خمسة مللي لتر من المثبت بعناية إلى كل طبق بتري، وتجنب السحب الماص مباشرة فوق المستعمرات. ستبدأ المستعمرات في الانفصال عن الآجار والطفو.أحكم إغلاق الأطباق باستخدام البارافيلم (parafilm)، ثم قم بتحضينها على هزاز دوار لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. انقل الأطباق للتخزين في درجة حرارة 4 °C طوال الليل. قم بإزالة سائل التثبيت بلطف باستخدام ماصة باستور متصلة بجهاز تفريغ.أضف 10 milliliters من منظم الصوديوم كاكوديلات بتركيز 100 nanomolar، وكلوريد الكالسيوم بتركيز five millimolar لغسل الغشاء الحيوي، ثم حضّن لمدة خمس دقائق. افصل مركز مستعمرة الغشاء الحيوي بعناية من طبق الآجار باستخدام ماصة باستور. لتجفيف المستعمرات بالهواء، قص ورق ترشيح السليلوز إلى أرباع، ثم اغمر قسمًا واحدًا في 100%ethanol.انقل مستعمرة واحدة من الغشاء الحيوي العائم بعناية إلى الورقة. ضع الورقة في طبق بتري مبطن بورق ترشيح جاف. ثم قم بتغطية الطبق، واتركه في غطاء كيميائي ليجف طوال الليل.من أجل الحفاظ على شكل مستعمرة الغشاء الحيوي، من المهم وضع ورقة السليلوز أسفل الغشاء الحيوي العائم بالكامل. وبمجرد وضعه على الورقة، لا يمكن إعادة ضبط الغشاء الحيوي. قم بتغطية قاعدة المجهر الإلكتروني بشريط كربوني، ثم استخدم ملاقط لنقل مستعمرات الغشاء الحيوي بعناية إلى القاعدة.بعد توصيل كل مستعمرة بالقاعدة عن طريق إضافة جسر رفيع من الشريط الكربوني، تُحفظ القواعد في مجفف لمدة 24 ساعة أو حتى وقت الحاجة. تتطلب هذه الخطوة يداً ثابتة ودقيقة، لأن الغشاء الحيوي يكون في هذه المرحلة هشاً للغاية وسهل الكسر. ويكمن التحدي في تثبيت جزء كبير من الغشاء الحيوي دون حدوث تشققات.في يوم الفحص، ضع المستعمرات في جهاز الطلاء بالترذيذ من الذهب والبالاديوم. قم بطلاء العينات لمدة دقيقتين بزاوية 60 درجة. كرر هذه الخطوة مرتين، مع تدوير العينات بمقدار 120 درجة بين كل مرة.أخيراً، قم بطلاء العينات مرة واحدة لمدة ثلاث دقائق من الأعلى. العينات الآن جاهزة للتصوير باستخدام SEM. تُظهر هذه الصور تكون الغشاء الحيوي لـ B.subtilis النامية في وسط MSgg المحفز لتكون الغشاء الحيوي.عند إضافة المثبط الجزيئي الصغير D-lysine، يقل تطور الغشاء الحيوي (pellicle). ومع زيادة تركيز المثبط، يظهر تكوين الغشاء الحيوي انخفاضاً مرتبطاً بهذه الزيادة. يوضح هذا الرسم البياني تأثير التعرض للإيثانول على بقاء الخلايا داخل مستعمرات الغشاء الحيوي، سواء كانت معالجة بمثبط D-lysine أو تركت دون معالجة.أظهرت المستعمرات المعالجة بـ D-lysine والمعرضة للإيثانول بتركيز 50% لمدة 10 دقائق انخفاضاً حاداً في معدل البقاء مقارنة بالجزء غير المعالج. وتوضح الصور المجهرية ثنائية العين من الأعلى أن المستعمرات التي نمت في وجود D-lysine كانت أصغر حجماً بشكل عام، وشكلت تجاعيد أقل وضوحاً من تلك التي تُركت دون معالجة. كما تكشف صور المجهر الإلكتروني الماسح للمستعمرات الحيوية الغشائية المجففة بنقطة حرجة عن المزيد من التغيرات في تطور الغشاء الحيوي.بدا مصفوف مادة البوليمرات خارج الخلوية، أو EPS، أشبه بخيوط العنكبوت في العينات غير المعالجة، بينما أظهرت العينات المعالجة تنظيماً أقل. وأخيراً، أظهر الفحص بدقة الخلايا البكتيرية الفردية أن الخلايا المعالجة تبدو متطاولة، وأقل تغطية بمادة EPS، وليست مرتبطة بجيرانها بنفس قوة ارتباط الخلايا غير المعالجة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن وضع إطار عمل ثابت لدراسة مثبطات الغشاء الحيوي أمر أساسي لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار.بمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إجراء مسح للجزيئات الصغيرة المثبطة للغشاء الحيوي في أقل من أسبوع إذا نُفذت العملية بشكل صحيح. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى، مثل استقصاء التعبير الجيني في خلايا الغشاء الحيوي المنفردة، من أجل الحصول على رؤى إضافية حول الهدف الذي يستهدفه المثبط الجزيئي الصغير. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل التأثير العام لمثبطات معينة للغشاء الحيوي على تطور الغشاء الحيوي والمقاومة للمضادات الحيوية.

methodologies-for-studying-b-subtilis-biofilms-as-model-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

المصدر: تاي، س. ب. وآخرون. الاضطراب المضاد للفيروس للأغشية الحيوية الممرضة باستخدام اللاكتوناز الهندسي لتبريد النصاب الطبيعي.  J. Vis. Exp. (2016)يعرض الفيديو طريقة لقياس الكتلة الحيوية للغشاء الحيوي في بكتيريا ممرضة، حيث يقارن الضوابط غير المعالجين بالعينات التي عولجت بإنزيم لتبريد النصاب. يعطل الإنزيم الإشارات البكتيرية أثناء الحضانة المبكرة، مما يقلل من التصاق الخلايا. بعد الغسيل وزيادة الحضانة، تتكون آبار التحكم في الأغشية الحيوية الكثيفة، بينما تظهر الآبار المعالجة تكوينا أقل. يستخدم صبغة...

قياس كمية كبت الغشاء الحيوي الناتج عن الإنزيم في البكتيريا الممرضة

المصدر: تاي، س. ب.، et.al. الاضطراب المضاد للفيروس للأغشية الحيوية الممرضة باستخدام اللاكتوناز الهندسي لتبريد النصاب الطبيعي.  J. Vis. Exp. (2016)يوضح هذا الفيديو عملية تثبيط تكوين الغشاء الحيوي من خلال إدخال إنزيم يعطل إشارات الخلايا البكتيرية. يمنع الإنزيم البكتيريا من إنتاج مواد بوليمرية خارج الخلية، مما يقلل من تطور الأغشية الحيوية على طبق صغير ذو قاع زجاجي. وأخيرا، يتم تصور بنية الغشاء الحيوي باستخدام الليكتينات الفلورية والمجهر الماسح بالليزر الكونفوكلي.

التقييم المجهري لتثبيط تكوين الأغشية الحيوية بواسطة الإنزيمات

المصدر: بوخر، ت.، وآخرون. منهجيات دراسة B . subtilis Biofilms كنموذج لتوصيف مثبطات الأغشية الحيوية للجزيئات الصغيرة. J. Vis. Exp. (2016)يوضح هذا الفيديو اختبار تكوين الحبيبات باستخدام Bacillus subtilis لتقييم مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تعطل تخليق المصفوفة وتطور الأغشية الحيوية، موفرا نموذجا لفحص المركبات التي تثبط النمو المرتبط بالسطح بشكل انتقائي دون التأثير على الخلايا الطافية.

تقييم تأثيرات المثبطات على تكوين الحبيبات في العصية السببية

المصدر: بوخر، ت.، وآخرون. منهجيات دراسة B. subtilis Biofilms كنموذج لتوصيف مثبطات الأغشية الحيوية للجزيئات الصغيرة. J. Vis. Exp. (2016).يوضح هذا الفيديو كيف تؤثر سلامة مصفوفة الأغشية الحيوية على مقاومة البكتيريا للإيثانول من خلال مقارنة وحدات تكوين المستعمرات في الأغشية الحيوية غير المعالجة والمعرضة للمثبطات. تظهر الوحدات الخالية من الفروع الخالية في عينات المعالجة بالمثبطات أن المصفوفة خارج الخلية ضرورية لحماية الخلايا المدمجة في الأغشية الحيوية من الإجهاد المضاد للميكروبات.

اختبار مقاومة الإيثانول لتقييم سلامة مصفوفة الأغشية الحيوية

المصدر: بوخر، ت.، وآخرون، منهجيات دراسة أغشية B. subtilis كنموذج لتوصيف مثبطات الأغشية الحيوية للجزيئات الصغيرة. J. Vis. Exp.(2016)يوضح هذا الفيديو تحضير مستعمرات الأغشية الحيوية البكتيرية الناضجة للتصوير عالي الدقة. يغطي خطوات التثبيت، والتجفيف، والتثبيت، وطلاء المعادن للحفاظ على شكل الأغشية الحيوية وتصورها.

تحضير مستعمرات الأغشية الحيوية البكتيرية للتحليل الشكلية

يعرض الفيديو مقايسة تشتت الأغشية الحيوية باستخدام لوحة متعددة الآبار. تعمل المعالجة العازلة والجلوكوز على تفكيك الأغشية الحيوية ، وتطلق البكتيريا ، بينما تحفز الأملاح الصفراوية الإجهاد ، وتحتفظ بالبكتيريا في المادة البوليمرية الواقية خارج الخلية. يؤكد التشتت العالي مع المخزن المؤقت والجلوكوز التفكيك الناجح للأغشية الحيوية ، والذي تم تقديره من خلال قياس وحدات تشكيل المستعمرة.

الكشف عن تفكيك الأغشية الحيوية من خلال فحص التشتت

تنتج معظم الالتهابات البكتيرية غشاء حيوي. بحكم بيئتها ، غالبا ما تكون البكتيريا المرتبطة بالغشاء الحيوي مقاومة للأدوية ظاهريا. وبالتالي فإن الجزيئات الجديدة المضادة للبكتيريا التي تقتل البكتيريا في الأغشية الحيوية هي أولوية قصوى. أنشأنا اختبارا للفحص السريع للمركبات المضادة للميكروبات الفعالة في القضاء على الأغشية الحيوية.

استهداف بيوفيلم أسوشيتد<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; استخدام ريسازورين استنادا الفحص المخدرات-القابلية

تظهر عدوى الأغشية الحيوية &lt; p class = 'jove_content'&gt; تحملا عاليا للعلاج الكيميائي. لا يوجد اختبار واحد يلتقط تعقيد الأغشية الحيوية. بدلا من ذلك ، هناك حاجة إلى فحوصات تكميلية. نقدم منصة فحص (تم تطويرها من أجل المكورات العنقودية الذهبية) تجمع بين فحوصات الجدوى والكتلة الحيوية ومصفوفة الأغشية الحيوية. يسمح باكتشاف الأدوية المضادة للأغشية الحيوية ، بما في ذلك تقييم تأثيرات العلاج الكيميائي طويلة الأجل.

ومنصة للفحوصات مكافحة بيوفيلم مناسبة لاستكشاف المكتبات مركب طبيعي

المنتجات الطبيعية تمثل نقاط انطلاق واعدة لتطوير الأدوية الجديدة والعوامل العلاجية. ومع ذلك، ونظراً للتنوع الكيميائي العالي، فإن العثور على مركبات علاجية جديدة من النباتات مهمة صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. نحن نصف نهجا مبسطا لتحديد جزيئات مضادات الميكروبات ومضادات الحيوية من مستخلصات نباتية وكسور.

منهجية النهج لتحديد رواية مضادات الميكروبات وجزيئات مضادة للبيريو فيلم من مقتطفات النباتات وكسور لمنع تسوس الأسنان

يقدم هذا البروتوكول منهجية لإجراء نمو الأغشية الحيوية وقياسات الكتلة الحيوية باستخدام أجهزة لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل العميق للبئر المجمعة ذاتيا لفحص الأغشية الحيوية الثابتة ذات الغطاء المربوط جيدا بإنتاجية عالية 96 جيدا.

توليد كتلة حيوية أكبر من الأغشية الحيوية البكتيرية باستخدام أجهزة الصفائح الدقيقة العميقة للوحة PCR

يصف هذا البروتوكول نهجا يجمع بين الأساليب الثابتة والديناميكية لتقييم فعالية أحماض البيروكسي العضوية للقضاء على الأغشية الحيوية في صناعة الألبان. ويمكن أيضا استخدام هذا النهج لاختبار فعالية التركيبات البيولوجية أو الكيميائية الجديدة لمكافحة الأغشية الحيوية.

تقييم فعالية الأحماض البيروكسي العضوية للقضاء على الأغشية الحيوية للألبان باستخدام نهج يجمع بين الطرق الثابتة والديناميكية

اكتشف منهجيات قابلة للتكرار لدراسة مثبطات الأغشية الحيوية وتأثيراتها على تعددية خلايا Bacillus subtilis. توفر هذه الطرق رؤى كمية ونوعية حول آليات عمل المثبطات المستهدفة للأغشية الحيوية.

منهجيات لدراسة

استكشف المزيد من الفيديوهات