عالية الإنتاجية آليا عزل بمساعدة من درجة الحرارة التي تراعي القاتلة المسوخ في

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام الروبوتات والمقايسات الموحدة لتبسيط عملية عزل الطفرات القاتلة الحساسة لدرجة الحرارة في Chlamydomonas، وذلك بهدف تحديد الجينات والمسارات الأساسية في هذا الكائن الحي. نحن مهتمون بكل من الحفاظ على الوظائف الخلوية الأساسية في حقيقيات النوى وتباعدها، والطريقة التي نفضلها لدراسة ذلك هي من خلال الطفرات التي تؤدي إلى تعطيل الجينات الأساسية في هذه العمليات.

لكي يعمل ذلك بشكل جيد، فأنت بحاجة إلى مجموعة شاملة حقاً من الطفرات، والطرق التي ستتعرف عليها هي وسيلتنا لإنتاج مثل هذه المجموعة. نحن نعمل على الطحالب الخضراء Chlamydomonas reinhardtii كنموذج ممثل للمملكة النباتية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الطفرات القاتلة الحساسة للحرارة يمكن العثور عليها على الأرجح في كل مسار حيوي أساسي.

لا تتطلب هذه الطريقة أي معرفة مسبقة أو طفرات موجهة. حيث يمكن استنتاج الوظيفة الجزيئية للجين المتحور مباشرة من النمط الظاهري المميت. ويساعدنا ذلك في اختيار طفرات مثيرة للاهتمام تعطل مسارات siala متنوعة تتجاوز التحكم في الدورة الخلوية.

لإجراء الطفرات الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية، يتم استزراع خلايا Chlamydomonas حتى تصل الكثافة الضوئية OD 750 إلى 0.2 إلى 0.5 في 100 مليلتر من محلول Tris-Acetate-Phosphate، أو TAP، تحت الإضاءة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية ومع الرج بسرعة 100 RPM. يتم إجراء الطفرات الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية بشكل مستقل في خلفيتين وراثيتين وفقاً للبروتوكول المكتوب. افحص عينة من كل مستنبت تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا حية وخالية من التلوث.

بعد ذلك، قم بتخفيف المزرعة حتى تصل الكثافة الضوئية OD 750 إلى 0.003، ثم قم بتغليف الزجاجة بورق ألومنيوم لضمان تجانس الكثافة لأن السلالة ذات نمط توزيع منوالي وتسبح اتجاهياً استجابةً للضوء. بعد ضبط كثافة المعلق وفقاً للبروتوكول المكتوب، قم بتركيب كاسيت أنابيب صغير يتناسب مع موزّع السوائل، وأجرِ سلسلة من عمليات الغسل للتعقيم وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لمنع التلوث. وباستخدام كاسيت موزّع سوائل مكون من ثماني سرنجات، قم بتوزيع 96 قطرة في أربع مجموعات، سعة كل قطرة 2 µL من المزرعة على أطباق مستطيلة جافة.

انقر برفق على حافة الطبق لضمان اندماج جميع القطرات في طبقة رقيقة من السائل، وقم بتغطية الأطباق فوراً لمنع التعرض للضوء. وعندما تجف، ضع الأطباق تحت مصباح UV مبيد للجراثيم لفترات زمنية يتم تحديدها تجريبياً لإعطاء إنتاجية مثالية من طفرات ts بين الناجين. بعد ذلك، انقل الأطباق إلى مكان مظلم لمدة تتراوح من 8 إلى 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

ثم ضع الأطباق في حاضنة عند درجة حرارة 21 درجة مئوية مع توفير الإضاءة. وبعد مرور 10 أيام تقريبًا، عندما تنمو المستعمرات دون أن تندمج، ضع الأطباق في المكدس المناسب لتكون بمثابة مصادر لعملية التقاط المستعمرات آليًا. ثم التقط المستعمرات لمصفوفات 384 على أطباق مستطيلة وازرعها عند درجة حرارة 21 درجة مئوية مع الإضاءة لمدة أسبوع تقريبًا.

باستخدام روبوت نقل المستعمرات، قم بتكثيف مصفوفات 384 إلى مصفوفة 1536 واترك الأطباق تنمو في الحاضنة عند 21 degree Celsius لمدة ثلاثة أيام تقريبًا. قم بنقل مصفوفات 1536 إلى طبقين لكل منها، وضع أحدهما في الحاضنة عند 21 degree Celsius والآخر في حاضنة عند 33 degree Celsius. وبعد مرور 24 ساعة عند 33 degree Celsius، انقل الأطباق من حاضنة 33 degree Celsius إلى مجموعة جديدة من الأطباق المسخنة مسبقاً وضعها في الحاضنة عند 33 degree Celsius.

بعد نمو لمدة ثلاثة أيام عند 33 درجة Celsius وخمسة أيام من النمو عند 21 درجة Celsius، استخدم كاميرا رقمية لتصوير لوحة شبكية مميزة بتسعة مؤشرات محاذاة. ثم قم بتصوير الأطباق، بالتناوب بين أطباق 21 درجة Celsius متبوعة بأطباق 33 درجة Celsius المقابلة لها، مع وضع جميع الأطباق في إطار ثابت للحفاظ على الاتجاه الدقيق. قم بمعالجة الصور المزدوجة لأطباق 21 و 33 درجة Celsius باستخدام برنامج مخصص لتحليل الصور من matte lab لإزالة الخلفية وتقسيم الصور إلى مصفوفة 1536.

سيقوم البرنامج بتحديد الكتلة الحيوية المكتشفة على أنها كثافة بكسلية كلية في كل موضع. قم بتحميل قائمة المستعمرات المختارة التي أنشأها البرنامج كملف تعليمات لروبوتات التقاط المستعمرات المنفردة. ثم قم بتجهيز أطباق المصدر والأطباق المستهدفة وفقاً لتعليمات الروبوت، واترك الروبوت يقوم بالتقاط المستعمرات المختارة ونقلها إلى مصفوفة.

ضع الأطباق المستهدفة في حاضنة بدرجة حرارة 21 degree Celsius لمدة خمسة أيام تقريباً لإنماء طبق مخزون. بعد إجراء مقايسة ثانية لتراكم الكتلة الحيوية وتكرار 100 طبق كتلة (block plates) وفقاً للبروتوكول النصي، قم بتكرار النسخة الحديثة من أطباق الـ 100 كتلة لإنتاج ثلاث نسخ. بعد إعداد الطبق الثالث في الروبوت وتنقيط المستعمرات، التقط صوراً مجهرية لمنطقة من كل نقطة في أطباق الفحص عند الزمن صفر، ثم ضع الأطباق في درجة حرارة 33 degrees Celsius للتحضين.

في نقاط زمنية متفاوتة بعد إخراج أطباق الفحص من الحاضنة عند درجة حرارة 33 degree Celsius، التقط صوراً مجهرية بسرعة، مع التأكد من معايرة حامل الأطباق ووحدة التحكم في المسرح بدقة للحصول على صور للخلايا نفسها في كل نقطة زمنية. حلل الصور المجهرية واختر الطفرات بناءً على المعايير المطلوبة. قم بنقل المجموعة النهائية المختارة إلى طبق آغار مصفوف بنظام 96، مع ضمان أن يحتوي كل طبق على طفرات من نفس نوع التزاوج ومقاومة العقاقير.

انقل كميات كبيرة من المستعمرات المرتبة في المصفوفة إلى وسط تحفيز الأمشاج الخالي من النيتروجين في أطباق ميكروية ذات 96 بئراً. قم بتحضين الأطباق تحت الضوء لمدة خمس ساعات تقريبًا للسماح بعملية تكوين الأمشاج. علّق الاستعلامات ذات أنماط التزاوج المعاكسة التي تحمل كاسيتات مقاومة بديلة في أنابيب تحتوي على وسط تحفيز الأمشاج الخالي من النيتروجين لإتمام عملية تكوين الأمشاج.

امزج العينات من طبق مستهدف في حجم خليط تزاوج قدره 20 µL. بعد مرور 10 دقائق تقريباً تحت الضوء، قم بنقل 5 µL من كل بئر مرتين؛ مرة واحدة على طبق TAP لاختبار الارتباط، ومرة واحدة على طبق TAP مضاف إليه 5 µM من paro و 9 µM من hygro لاختبار التكامل.

بعد تحضين أطباق اختبار التكامل، قم بنسخ الأطباق إلى نسختين لتحديد النمط الظاهري الحساس للحرارة (ts). اختبر المستعمرات لتحديد النمط الظاهري ts وفقاً للبروتوكول المكتوب. بعد تشعيع الخلايا المفردة من Chlamydomonas، تُترك الخلايا لتنمو لمدة عشرة أيام في درجة حرارة مسموح بها، ثم يتم التقاطها بتنسيق مصفوفي، كما هو موضح هنا.

يتم دمج الأطباق الناتجة بتنسيق 384 في مصفوفة 1536. وقد تم اختبار ثلاثة أوقات للتعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) لإنتاج طفرات Chlamydomonas ts. ومن الناحية التجريبية، حقق وقت التعرض البالغ 1.5 دقيقة أكبر عدد من طفرات ts.

ومع ذلك، فقد أسفر وقت التعرض البالغ دقيقة واحدة عن الحصول على معظم المرشحين لدورة الخلية وبفارق كبير. في هذه التجربة، تم إجراء مقايسين متتاليين للنمط الظاهري للحساسية الحرارية (ts)، وتم عزل حوالي 3000 طفرة حساسة للحرارة (ts) وتوصيفها ظاهرياً باستخدام المجهر بنظام التصوير المتقطع (time-lapsed microscopy). وكما يظهر هنا، لإزالة الجينات المتكررة بشكل كبير من مسار التحليل اللاحق، تم إجراء اختبارات التكامل والارتباط مع الجينات الموصوفة مسبقاً والتي تمتلك أكثر من أليلين، وذلك مقابل المرشحين الذين تم جمعهم حديثاً.

لا تظهر هذه المستعمرات أي تكامل مع العينة المستعلم عنها، وبالتالي فهي تمثل أليلات hs جديدة للجين المستعلم عنه. وعادةً ما يتم استبعاد هذه المستعمرات من المزيد من التوصيف. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بإنتاجية عالية.

يمكن عزل الآلاف من الطفرات الحساسة للحرارة (ts) في جولتين أو ثلاث جولات فقط من التطفير. وتتمثل الخطوة الأساسية بعد عزل هذه الطفرات في اختيار مجموعة فرعية منها لمزيد من الدراسة، ومن المثير للاهتمام رؤية نطاق الأنماط الظاهرية المميتة. إذ يوفر تحديد الأنماط الظاهرية مؤشرات حول الوظيفة الجزيئية، كما يساعدنا في ترتيب أولويات الطفرات المختارة للدراسات اللاحقة.

ضع في اعتبارك أن الطفرات قد تحتوي على مئات أو آلاف الطفرات في جينوماتها. وعادة ما تكون طفرة واحدة فقط هي المسببة، رغم أن بعض الحالات تتطلب طفرتين لظهور النمط الظاهري الحساس للحرارة (ts)، ويمكن تحديد ذلك من خلال تحليل الرباعيات (tetra analysis). وباتباع هذا الإجراء، يمكن تحديد الطفرات المسببة عن طريق تحليل تسلسل الجيل القادم (NGS) للعينات المجمعة. ستظهر الجينات المحددة أحياناً طفرات تشير إلى وظيفتها، أو قد تكون تسلسلات جديدة غير معروفة، وهو أمر مثير للاهتمام وباعث على الحماس.

لقد كانت كليميدوموناس (Chlamydomonas) نظاماً نموذجياً رائعاً لدراسة بيولوجيا الخلية في المملكة النباتية. ومن شأن الإجراءات التي استمعتم إليها أن تفتح المجال لدراسة هذا الكائن الحي في عمليات أساسية لم يتم فحصها نسبياً، ونأمل أن تكون النتائج ذات صلة بالمملكة النباتية بشكل أوسع أيضاً.