عالية الإنتاجية آليا عزل بمساعدة من درجة الحرارة التي تراعي القاتلة المسوخ في كلاميدوموناس reinhardtii

الهدف العام من الإجراء هو استخدام الروبوتات والمقايسات الموحدة لتبسيط عزل الطفرات المميتة الحساسة لدرجة الحرارة في الكلاميدوموناس من أجل تحديد الجينات والمسارات الأساسية في هذا الكائن الحي. نحن مهتمون بكل من الحفاظ على الوظائف الخلوية الأساسية وتباعدها في حقيقيات النوى. والطريقة التي نحب أن ندرس بها هي مع الطفرات التي تعطل الجينات الأساسية في هذه العمليات.

لكي يعمل ذلك بشكل جيد ، فأنت بحاجة إلى مجموعة شاملة حقا من المسوخ والأساليب التي ستسمع عنها هي طريقتنا في إنشاء مثل هذه المجموعة. نحن نعمل في الطحالب الخضراء Chlamydomonas reinhardtii كممثل للمملكة النباتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الطفرات المميتة الحساسة لدرجة الحرارة يمكن العثور عليها على الأرجح في كل مسار أساسي.

تتطلب الطريقة معرفة مسبقة أو طفرات مستهدفة. اقترحت الوظيفة الجزيئية للجين المتحور على الفور من النمط الظاهري القاتل. يساعدنا هذا في اختيار طفرات مثيرة للاهتمام تعطل مسارات سيالا المتنوعة خارج التحكم في دورة الخلية.

لتنفيذ ثقافة الطفرات بالأشعة فوق البنفسجية خلايا الكلاميدوموناس حتى OD 750 من 0.2 إلى 0.5 في 100 مل من Tris-Acetate-Phosphate ، أو TAP ، تحت الضوء عند 25 درجة مئوية واهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة. يتم إجراء طفرات الأشعة فوق البنفسجية بشكل مستقل في خلفيتين وراثيتين وفقا لبروتوكول النص. تحقق من عينة من كل مزرعة تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا قابلة للحياة وخالية من التلوث.

بعد ذلك ، قم بتخفيف الثقافة إلى OD 750 من 0.003 ثم لف الزجاجة بورق الألمنيوم لضمان كثافة متجانسة لأن السلالة مشروطة وتسبح بشكل اتجاهي استجابة للضوء. بعد ضبط كثافة التعليق وفقا لبروتوكول النص ، قم بتوصيل كاسيت أنبوبي صغير يناسب موزع السوائل وقم بإجراء سلسلة من الغسالات للتعقيم ، وفقا لتعليمات المصنع ، لمنع التلوث. باستخدام كاسيت موزع سائل مكون من ثماني محاقن ، قم بتوزيع أربع قطرات في 96 قطرة من كل من ميكرولترين من المزرعة على ألواح مستطيلة جافة.

اضغط برفق على حافة اللوحة لضمان دمج جميع القطرات في ورقة رقيقة من السائل وقم بتغطية الألواح على الفور لمنع التعرض للضوء. عند التجفيف ، ضع الألواح تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية المبيد للجراثيم لفترات زمنية محددة تجريبيا لإعطاء العائد الأمثل للطفرات ts بين الناجين. بعد ذلك ، انقل الأطباق إلى الظلام لمدة ثماني إلى 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

ثم ضع الألواح في حاضنة 21 درجة مئوية مع إضاءة. بعد ما يقرب من 10 أيام عندما تزرع المستعمرات ولكن لا يتم دمجها ، قم بتحميل الألواح في المكدس ذي الصلة كمصادر لقطف المستعمرات الآلية. ثم اختر مستعمرات ل 384 مصفوفة على ألواح مستطيلة وقم بزراعتها عند 21 درجة مئوية مع الإضاءة لمدة أسبوع تقريبا.

باستخدام روبوت طلاء طبق الأصل ، قم بتكثيف المصفوفات ال 384 في مصفوفة 1536 واسمح للألواح بالنمو في حاضنة 21 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام تقريبا. قم بتكرار المصفوفات 1536 إلى لوحين لكل منهما وضع أحدهما في حاضنة 21 درجة مئوية والآخر في حاضنة 33 درجة مئوية. بعد 24 ساعة عند 33 درجة مئوية ، قم بتكرار الألواح من حاضنة 33 درجة مئوية إلى مجموعة جديدة من الألواح الدافئة مسبقا وضعها في حاضنة 33 درجة مئوية.

بعد ثلاثة أيام من النمو عند 33 درجة مئوية وخمسة أيام من النمو عند 21 درجة مئوية ، استخدم كاميرا رقمية لتصوير لوحة شبكية مميزة بتسعة مؤشرات محاذاة. ثم قم بتصوير الألواح بالتناوب مع ألواح 21 درجة مئوية متبوعة بألواح 33 درجة مئوية المقابلة مع وضع جميع الألواح في إطار ثابت للحفاظ على الاتجاه الدقيق. قم بمعالجة صور اللوحة المقترنة 21 و 33 باستخدام برنامج تحليل صور مختبر غير لامع مخصص للتخلص من الخلفية وتقسيم الصور إلى مصفوفة 1536.

سيحدد البرنامج الكتلة الحيوية المكتشفة كإجمالي شدة البكسل في كل موضع. قم بتحميل قائمة المستعمرات المحددة التي تم إنشاؤها بواسطة البرنامج كملف تعليمات لروبوتات اختيار المستعمرة الواحدة. ثم قم بإعداد لوحات المصدر والهدف وفقا لتعليمات الروبوتات واسمح للروبوت باختيار المستعمرات المحددة إلى مصفوفة.

ضع الألواح المستهدفة في حاضنة 21 درجة مئوية لمدة خمسة أيام تقريبا لزراعة صفيحة مخزون. بعد إجراء اختبار ثان لتراكم الكتلة الحيوية وتكرار 100 لوحة كتلة وفقا لبروتوكول النص ، قم بتكرار النسخة الجديدة من 100 لوحة كتلة إلى ثلاث نسخ. بعد إعداد اللوحة الثالثة في الروبوت ، واكتشاف المستعمرات ، التقط صورا مجهرية لمنطقة من كل بقعة من لوحات الفرز في أوقات الصفر وضع الألواح عند 33 درجة مئوية للحضانة.

في نقاط زمنية مختلفة بعد إزالة لوحات الفرز من حاضنة 33 درجة مئوية ، التقط بسرعة صور مجهرية ، مع التأكد من معايرة حامل اللوحة ووحدة التحكم في المرحلة بدقة للحصول على صور لنفس الخلايا في كل نقطة زمنية. قم بتحليل الصور المجهرية واختيار المسوخ بناء على المعايير المطلوبة. حدد المجموعة النهائية المحددة في لوحة أجار 96 مصفوفة ، مع التأكد من أن كل صفيحة تحتوي على طفرات من نفس نوع التزاوج ومقاومة الأدوية.

انقل كميات كبيرة من المستعمرات المصفوفة إلى وسط تحريض الأمشاج الخالي من النيتروجين على 96 صفيحة دقيقة جيدا. احتضان الصفائح تحت الضوء لمدة خمس ساعات تقريبا للسماح بتكوين الأمشاج. قم بتعليق الاستعلامات مع أنواع التزاوج المعاكسة التي تؤوي أشرطة المقاومة البديلة في أنابيب باستخدام وسيط تحريض الأمشاج الخالي من النيتروجين لتكوين الأمشاج.

امزج العينات من اللوحة المستهدفة في خليط تزاوج بحجم 20 ميكرولترا. بعد حوالي 10 دقائق تحت الضوء ، ضع خمسة ميكرولترات من كل بئر مرتين. مرة واحدة على لوحة TAP لاختبار الربط ومرة واحدة على TAP بالإضافة إلى خمسة ميكرومول بارو بالإضافة إلى تسعة ميكرومول hygro لاختبار التكملة.

بعد احتضان لوحات اختبار التكملة ، قم بتكرار اللوحات في نسختين لتحديد النمط الظاهري ts. اختبار مستعمرات النمط الظاهري ts وفقا لبروتوكول النص. بعد تشعيع الخلايا المفردة من الكلاميدوموناس ، يسمح للخلايا بالنمو لمدة عشرة أيام عند درجة حرارة متساهلة ، ثم يتم قطفها في شكل مصفوف ، كما هو موضح هنا.

يتم دمج اللوحات الناتجة بتنسيق 384 في مصفوفة 1536. تم اختبار ثلاث أوقات للتعرض للأشعة فوق البنفسجية لتوليد طفرات الكلاميدوموناس ts. من الناحية التجريبية ، أسفر وقت التعرض البالغ 1.5 دقيقة عن معظم طفرات TS.

ومع ذلك ، إلى حد بعيد ، أسفر وقت التعرض لمدة دقيقة واحدة عن معظم مرشحي دورة الخلية. في هذه التجربة ، تم إجراء فحصين متتابعين للنمط الظاهري ts وتم عزل حوالي 3000 ts من الطفرات وتميزت ظاهريا بالفحص المجهري بمرور الوقت. كما هو موضح هنا ، لإزالة الجينات المتكررة للغاية من خط الأنابيب المتدفق ، تم إجراء اختبار التكامل والارتباط مع الجينات المميزة بالفعل مع أكثر من أليلين ، ضد المرشحين الذين تم جمعهم حديثا.

تظهر هذه المستعمرات أي تكامل مع الاستعلام ، وبالتالي فهي أليلات ts جديدة للجين الذي تم الاستعلام عنه. يتم استبعادها بشكل عام من مزيد من التوصيف. بمجرد إتقان هذه التقنية يمكن القيام بها بإنتاجية عالية.

يمكن عزل الآلاف من طفرات ts في جولتين أو ثلاث جولات فقط من الطفر. تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية بعد عزل طفرات ts في تحديد مجموعة فرعية لمزيد من الدراسة ومن المثير للاهتمام رؤية مجموعة الأنماط الظاهرية القاتلة. يوفر التنميط الظاهري تلميحات إلى الوظيفة الجزيئية ويساعدنا أيضا على تحديد أولويات المسوخ لمزيد من الدراسة.

ضع في اعتبارك أن الطفرات يمكن أن يكون لها مئات أو آلاف الطفرات في جينوماتها. عادة ما يكون واحد فقط مسببا ، على الرغم من أن هناك حاجة في بعض الأحيان إلى طفرتين للنمط الظاهري ts ويمكن تحديد ذلك عن طريق تحليل رباعي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تحديد الطفرات المسببة عن طريق تحليل تسلسل الجيل التالي للجينات المجمعة ، سيكون للجينات المحددة أحيانا طفرات تشير إلى الوظيفة أو يمكن أن تكون تسلسلات جديدة غير معروفة ، وهو أمر مثير للاهتمام ومثير.

كان الكلاميدوموناس نظاما نموذجيا رائعا لدراسة بيولوجيا الخلية في المملكة النباتية. يجب أن تفتح الإجراءات التي سمعت عنها دراسة هذا الكائن الحي للعمليات الأساسية التي لم يتم فحصها نسبيا ونأمل أن تكون النتائج ذات صلة أيضا بالمملكة النباتية الأوسع أيضا.