ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تطوير طريقة للفحص الآلي سريع التدفق للبروتوبلاست النباتية، وتحديداً لمعالجة العقبة الحالية المتمثلة في الفحص الأولي لأعداد كبيرة من أهداف تحرير الجينوم وإسكات الجينات. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية. وتكمن الميزة الأساسية لهذه التقنية في أنها تتيح إنتاج وتحويل البروتوبلاست آلياً وبإنتاجية عالية من أجل الفحص المتوازي السريع لوظيفة المحفز في التعبير الجيني.

سيتم عرض هذا الإجراء باستخدام مستنبت تعليق تباكو برايت يلو تو (tobacco bright yellow two)، المعروف اختصاراً بـ BY-2، وهو مستنبت شائع الاستخدام. ابدأ بتنمية مستنبت BY-2 في دورق إرلنماير، كما هو موضح في نص البروتوكول. وفي يوم عزل البروتوبلاست، اخلط المستنبت جيداً نظراً لأن الخلايا تترسب بسرعة، ثم انقل 6 mL من المستنبت إلى أنبوب طرد مركزي بقاعدة مخروطية سعة 15 mL.

اترك الخلايا تترسب لمدة 10 دقائق على الأقل. اضبط حجم الخلايا المترسبة ليكون 50% من الحجم الإجمالي عن طريق إزالة الحجم المناسب من السائل الطافي. رج الأنبوب عن طريق قلبه، ثم استخدم ماصات واسعة الفوهة لنقل 500 µL من معلق الخلايا إلى كل بئر من أطباق الستة آبار من أجل عملية الهضم.

تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في تشغيل جميع مكونات النظام الروبوتي، وهي ناقل الأطباق الدقيقة، وجهاز مناولة السوائل، وقارئ الأطباق متعدد الأوضاع، والموزع متعدد الأوضاع، ومسخن أو مبرد الأطباق، وأجهزة الكمبيوتر. بعد ذلك، افتح برنامج جدولة مهام ناقل الأطباق الذي يربط ناقل الأطباق الدقيقة بالمعدات الأخرى لتمكين نقل الأطباق بين كل قطعة من المعدات. وفي برنامج ناقل الأطباق، حدد المواصفات الفنية للأدوات المختبرية المستخدمة في البروتوكول.

انقر على Setup من شريط الأدوات الرئيسي واختر الأمر Manage Container Types. حدد نوع الحاوية (Container Type) المناسب من قائمة أنواع الحاويات الموجودة. حدد المواصفات الفنية لجميع الأدوات المختبرية التي سيتعامل معها ناقل الأطباق.

الخطوة التالية هي تحديد موضع البداية والنهاية لكل حاوية. انقر فوق علامة التبويب Start/End في بروتوكول معين. حدد موضع البداية لكل حاوية وقم بتأشير المربع الخاص بـ Lidded أو Unlidded عند كل من موضعي البداية والنهاية.

بعد تحديد مواضع البداية والنهاية لكل قطعة من الأدوات المخبرية، قم بتحميل جميع الأطباق يدويًا في موضع البداية لسير العمل بالكامل. حمّل أطباق الفرز الفلوري ذات 96 بئرًا في الفندق الثاني، والأطباق ذات الستة آبار التي تحتوي على خلايا BY-2 في الفندق الثالث، وطبقًا ذا آبار عميقة بـ 96 بئرًا سيُستخدم للتحول على العش الثاني من مسخن أو مبرد الأطباق، وأنبوبًا مخروطيًا سعة 50 milliliter يحتوي على محلول الإنزيم على الموزع متعدد الأوضاع. لإجراء عملية التحول في البروتوكول، قم بتعبئة مسبقة لكل بئر من آبار الطبق ذي الآبار العميقة بـ 10 µL من الـ plasma DNA الذي يحتوي على بنية تقرير البروتين الفلوري البرتقالي، ثم قم بتحضينها على مسخن أو مبرد الأطباق عند 4 °C.

قم بتحميل جميع المستلزمات والأطباق على منصة مناولة السوائل الآلية في المواقع المحددة. قم بتحميل طبق ذي 96 بئرًا محمل مسبقًا بـ 200 µL من محلول polyethylene glycol بتركيز 40% في كل بئر في العمود الأول. قم بتحميل صندوق رؤوس الماصات في العش ثمانية.

لتحديد موقع كل عنصر في برنامج منصات مناولة السوائل الآلية، اختر "Tools" من القائمة ثم انقر على "Labware Editor". اختر نوع الأدوات المخبرية من القائمة المنسدلة. اختر علامة التبويب "Main Protocol" وانقر على "Configure Labware" لتحديد موضع كل قطعة من الأدوات المخبرية.

انقر فوق Run لتهيئة جميع الأجهزة التي ستُستخدم في البروتوكول. وأخيراً، في نافذة Work Explorer، انقر فوق Add Work Unit للتحقق من جميع الأدوات المخبرية في النظام وبدء البروتوكول الآلي. إن الجزء الأكثر حساسية في الإجراء هو تحويل البروتوبلاست.

نظراً لأن عملية التحول تتم بواسطة النظام الروبوتي، فمن الضروري إعداد البروتوكولات الآلية بشكل صحيح. ولأغراض هذا الفيديو، سيتم عرض خطوات مختارة فقط من البروتوكولات الآلية. خلال بروتوكول التحول، تقوم منصة مناولة السوائل الآلية بسحب 70 µL من محلول البروتوبلاست من الطبق ذي الستة آبار وتوزيعه في الطبق ذي الـ 96 بئراً عميقاً في العش السادس.

بعد ذلك، تُستخدم رؤوس ماصات جديدة لسحب 70 µL ببطء من محلول البولي إيثيلين جليكول عالي اللزوجة من لوحة الآبار العميقة المحملة مسبقاً، ثم يُوزع المحلول بالكامل في الآبار المناسبة من لوحة الآبار العميقة. تالياً، تقوم منصة مناولة السوائل الآلية بنقل لوحة الآبار العميقة من الموضع السادس إلى الموضع التاسع، حيث يقوم ناقل الألواح بالتقاط اللوحة ونقلها إلى محطة هز الألواح وهزها بسرعة 1500 RPM لمدة 30 ثانية. وبعد فترة حضانة لمدة 20 دقيقة بدون هز للسماح بتوازن البروتوبلاست، يقوم ناقل الألواح بنقل لوحة الآبار العميقة ذات 96 بئراً إلى الموزع متعدد الأنماط وتفعيل بروتوكول الغسل.

عند اكتمال بروتوكول عزل وتحويل البروتوبلاست الآلي، أخرج الطبق الذي يحتوي على البروتوبلاست المحولة من الفندق الأول لنظام الروبوتات. قم بتشغيل المجهر المقلوب والكاميرا والمصباح الفلوري. اختر العدسة الشيئية 10X للتركيز الأولي على البروتوبلاست.

قم بتشغيل مصباح الهالوجين وأغلق الغالق الخاص بالمصباح الفلوري. ضع الطبق على نظام المجهر وقم بضبط التركيز على البروتوبلاستات باستخدام المجال المضيء. بعد ذلك، أطفئ مصباح الهالوجين وافتح الغالق الخاص بالمصباح الفلوري.

اختر مجموعة مرشحات Cy3/TRITC لتصور البروتين الفلوري البرتقالي الذي تعبر عنه البروتوبلاستات المعدلة وراثياً. قم بمسح كل بئر لتحديد عدد البروتوبلاستات التي تعبر عن الوسم الفلوري. أدى الهضم الإنزيمي للبروتوبلاستات في الظروف المحددة في هذا البروتوكول إلى الحصول على 2,820,000 بروتوبلاست لكل لوحة ذات ستة آبار.

تم تقييم الفقد في تركيز البروتوبلاست بعد كل خطوة نقل في البروتوكول. فبعد بروتوكول الهضم، تم نقل 11, 500 بروتوبلاست إلى كل بئر من آبار أطباق الـ 96 بئرًا العميقة. وبمجرد اكتمال بروتوكول التحويل، تم نقل 1, 230 بروتوبلاست إلى طبق الفرز الفلوري المكون من 96 بئرًا.

لضمان عدم تضرر البروتوبلاستات نتيجة مراحل السحب المتعددة بالماصة، تم تقييم حيويتها عن طريق الصبغ بـ propidium iodide. وأظهرت النتائج عدم وجود فرق معنوي في الحيوية بعد عملية الهضم، وبعد النقل إلى طبق الفحص الفلوري ذي 96 بئراً، وبعد بروتوكول التحويل. وقد نجح بروتوكول التحويل في إنتاج خلايا معدلة وراثياً تعبر عن البروتين الفلوري البرتقالي، رغم أن كفاءة التحويل كانت منخفضة، حيث بلغت حوالي 2% فقط؛ ويعزى ذلك إلى استخدام بلازميد ثنائي كبير، وعدم تحسين البروتوكول خصيصاً لبروتوبلاستات BY-2.

أظهرت المقاييس التي تم الحصول عليها للمسار الزمني للبروتوكول أن الجزء الأكبر من الوقت يُستهلك خلال مرحلة الهضم (Digestion). وقد استغرقت العملية الكاملة لعزل البروتوبلاست وتحويلها ثلاث ساعات و50 دقيقة و53 ثانية دون الحاجة إلى أي تدخل خارجي من المشغل. وبمجرد إعدادها بشكل صحيح، يمكن للروبوت تنفيذ هذه التقنية في أقل من أربع ساعات.

بعد تطويرها، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية لإجراء عمليات جينومية عالية الإنتاجية للمحاصيل، مثل تحرير الجينوم وفحص المحفزات.