ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تطوير طريقة للفحص السريع والآلي عالي الإنتاجية للبروتوبلاستات النباتية ، على وجه التحديد لمعالجة عنق الزجاجة الحالي في الفحص المبكر لأعداد كبيرة من أهداف تحرير الجينوم وإسكات الجينات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح إنتاج البروتوبلاست الآلي عالي الإنتاجية وتحويله للفحص المتوازي السريع لوظيفة المحفز في التعبير الجيني.

سيتم إثبات هذا الإجراء باستخدام ثقافة التعليق ذات اللون الأصفر الفاتح أو BY-2 المستخدمة على نطاق واسع. ابدأ بتنمية ثقافة BY-2 في قارورة Erlenmeyer ، كما هو موضح في نص البروتوكول. في يوم عزل البروتوبلاست ، امزج المزرعة جيدا حيث ستستقر الخلايا بسرعة ، وانقل ستة ملليلتر من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي القاع سعة 15 مل.

دع الخلايا تستقر لمدة 10 دقائق على الأقل. اضبط حجم الخلية المعبأة على 50٪ من الحجم الكلي عن طريق إزالة الحجم المناسب للطاف. قم بهز الأنبوب عن طريق قلبه ثم استخدم ماصات ذات تجويف عريض لماصة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة من ستة آبار للهضم.

تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في تشغيل جميع مكونات نظام الروبوتات ، وهي محرك الصفيحة الدقيقة ، ومعالج السوائل ، وقارئ الألواح متعدد الأوضاع ، وموزع الأوضاع المتعددة ، وسخان اللوحة أو المبرد ، وأجهزة الكمبيوتر. بعد ذلك ، افتح برنامج جدولة مهام محرك اللوحة الذي يدمج محرك اللوحة الدقيقة مع المعدات الأخرى لتمكين نقل الألواح بين كل قطعة من المعدات. في برنامج محرك اللوحة ، حدد المواصفات الفنية لأدوات المختبر المستخدمة في البروتوكول.

انقر فوق إعداد من شريط الأدوات الرئيسي وحدد الأمر إدارة أنواع الحاويات. حدد نوع الحاوية المناسب من قائمة أنواع الحاويات الموجودة. حدد المواصفات الفنية لجميع أدوات المختبر التي سيواجهها محرك الألواح.

الخطوة التالية هي تحديد موضعي البدء والنهاية لكل حاوية. انقر فوق علامة التبويب بدء/إنهاء في بروتوكول معين. حدد موضع البدء لكل حاوية وحدد المربع الخاص بغطاء وبدون غطاء في كل من موضعي البداية والنهاية.

بعد تحديد موضعي البدء والنهاية لكل قطعة من أدوات المختبر ، قم بتحميل جميع اللوحات يدويا في موضع البداية لسير العمل بأكمله. قم بتحميل ألواح الفحص الفلورية المكونة من 96 بئرا في الفندق الثاني ، وألواح الآبار الستة مع خلايا BY-2 في الفندق الثالث ، ولوحة بئر بعمق 96 سيتم استخدامها للتحويل إلى العش الثاني من سخان اللوحة أو المبرد ، وأنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على محلول الإنزيم على الموزع متعدد الأوضاع. لإجراء التحول في البروتوكول ، قم بتحميل كل بئر من لوحة البئر التي يبلغ عمقها 96 بسعة 10 ميكرولترات من الحمض النووي للبلازما الذي يحتوي على بروتين الفلورسنت البرتقالي واحتضانه على سخان اللوحة أو المبرد عند أربع درجات مئوية.

قم بتحميل جميع المستلزمات والألواح على منصة معالجة السوائل الآلية في المواقع المحددة. قم بتحميل لوح 96 بئرا محملة مسبقا ب 200 ميكرولتر من محلول جلايكول بولي إيثيلين بنسبة 40٪ لكل بئر في العمود الأول. قم بتحميل صندوق من أطراف الماصة في العش الثامن.

لتحديد موقع كل عنصر في برنامج الأنظمة الأساسية التلقائية لمعالجة السوائل، حدد أدوات من القائمة وانقر فوق محرر برامج المعمل. حدد نوع أدوات المختبر من القائمة المنسدلة. حدد علامة التبويب البروتوكول الرئيسي وانقر فوق تكوين Labware لتحديد موضع كل قطعة من أدوات المختبر.

انقر فوق تشغيل لتهيئة جميع الأجهزة التي سيتم استخدامها في البروتوكول. أخيرا ، في نافذة مستكشف العمل ، انقر فوق إضافة وحدة عمل للتحقق من جميع برامج المختبر في النظام وبدء البروتوكول الآلي. الجزء الأكثر حساسية من الإجراء هو تحويل البروتوبلاست.

نظرا لأن التحويل يتم بواسطة نظام الروبوتات ، فمن الأهمية بمكان أن يتم إعداد البروتوكولات الآلية بشكل صحيح. لأغراض هذا الفيديو، سيتم عرض الخطوات المحددة فقط في البروتوكولات التلقائية. أثناء بروتوكول التحويل ، تستنشق منصة معالجة السوائل الآلية 70 ميكرولترا من محلول البروتوبلاست من الصفيحة المكونة من ستة آبار وتوزعها في صفيحة البئر التي يبلغ عمقها 96 في العش السادس.

بعد ذلك، يتم استخدام أطراف ماصة جديدة لشفط 70 ميكرولترا ببطء من محلول جلايكول البولي إيثيلين عالي اللزوجة من لوحة البئر العميقة المحملة مسبقا وتوزيع المحلول بالكامل في الآبار القابلة للتطبيق في لوحة البئر العميقة. بعد ذلك ، تقوم منصة معالجة السوائل الآلية بتحريك لوحة البئر العميقة من الستة التالية إلى العش التاسع حيث يلتقط محرك اللوحة اللوحة وينقلها إلى محطة شاكر اللوحة ويهزها بسرعة 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. بعد حضانة لمدة 20 دقيقة دون اهتزاز للسماح بتوازن البروتوبلاست ، يقوم محرك الألواح بتحريك لوحة البئر التي يبلغ عمقها 96 إلى الموزع متعدد الأوضاع ويؤدي إلى تشغيل بروتوكول الغسيل.

عند اكتمال بروتوكول عزل وتحويل البروتوبلاست الآلي ، قم بإزالة اللوحة مع البروتوبلاست المحول من أحد نظام الروبوتات في الفندق. قم بتشغيل المجهر المقلوب والكاميرا ومصباح الفلورسنت. حدد هدف 10X للتركيز الأولي على البروتوبلاستات.

قم بتشغيل مصباح الهالوجين وأغلق غالق مصباح الفلورسنت. قم بتحميل اللوحة على نظام المجهر وركز على البروتوبلاست باستخدام المجال الساطع. بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل لمبة الهالوجين وافتح مصراع مصباح الفلورسنت.

حدد مجموعة مرشح Cy3 / TRITC لتصور البروتين الفلوري البرتقالي الذي تعبر عنه البروتوبلاستات المعدلة وراثيا. امسح كل بئر لتحديد عدد البروتوبلاستات التي تعبر عن علامة الفلورسنت. نتج عن هضم الإنزيم للبروتوبلاست في الظروف المحددة في هذا البروتوكول 2،820،000 بروتوبلاست لكل صفيحة من ستة آبار.

تم تقييم الخسارة في تركيز البروتوبلاست بعد كل خطوة نقل في البروتوكول. بعد بروتوكول الهضم ، تم نقل 11،500 بروتوبلاست إلى كل بئر من ألواح الآبار التي يبلغ عمقها 96 بئر. بمجرد اكتمال بروتوكول التحويل ، تم نقل 1،230 بروتوبلاست إلى لوحة فحص الفلورسنت المكونة من 96 بئرا.

للتأكد من أن مراحل سحب العينات المتعددة لم تلحق الضرر بالبروتوبلاست ، تم فحص قابليتها للحياة عن طريق تلطيخ يوديد البروبيديوم. أظهرت النتائج عدم وجود فرق كبير في قابلية البقاء بعد الهضم ، وبعد النقل إلى لوحة غربلة الفلورسنت المكونة من 96 بئرا ، وبعد بروتوكول التحويل. نجح بروتوكول التحويل في توليد خلايا معدلة وراثيا تعبر عن البروتين الفلوري البرتقالي على الرغم من أن كفاءة التحويل كانت منخفضة ، إلا حوالي 2٪ ويرجع ذلك إلى البلازما الثنائية الكبيرة المستخدمة والبروتوكول الذي لم يتم تحسينه خصيصا للبروتوبلاستات BY-2.

أظهرت المقاييس التي تم الحصول عليها للمسار الزمني للبروتوكول أن الاستثمار الرئيسي للوقت يتم إنفاقه خلال مرحلة الهضم. كانت المدة الكاملة لعزل البروتوبلاست وتحويله ثلاث ساعات و 50 دقيقة و 53 ثانية دون الحاجة إلى إدخال خارجي من المشغل. بمجرد إعدادها بشكل صحيح ، يمكن للروبوت تنفيذ هذه التقنية في أقل من أربع ساعات.

بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية لإجراء إجراءات جينومية عالية الإنتاجية للمحاصيل ، مثل تحرير الجينوم وفحص المروج.