بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent كولاي و ضمة الكوليرا

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد بكتيريا مختصة بسرعة وسهولة في نفس اليوم. هم ضروريون للتحول. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء البكتيريا أولا على LB agar واحتضانها لمدة أربع إلى ست ساعات.

بعد ذلك ، يتم حصاد العشب البكتيري بعناية من سطح الأجار ، ويتم تعليق الحبيبات في ماء بارد معقم أو عازلة. ثم يتم غسل الحبيبات البكتيرية ثلاث مرات عند أربع درجات مئوية وإعادة تعليقها في 40 ميكرولتر. أخيرا ، يتم تزويد الخلايا المختصة بالكهرباء في وجود الحمض النووي.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر مستويات من التحول البكتيري مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقة التقليدية التي تتطلب معدات كبيرة وكميات كبيرة من المزارع البكتيرية والمخازن المؤقتة المعقمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنه يمكن تحضير البكتيريا الطازجة والمختصة تقريبا من أي سلالة معملية في نفس اليوم الذي يتم فيه التخطيط للتحول دون الحاجة إلى أجهزة طرد مركزي كبيرة أو دوارات أو قادة المخازن المؤقتة والثقافات المعقمة بشكل عام ، لن يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة كثيرا لأن هذا مجرد اختصار للتقنيات المستخدمة بشكل شائع في مختبرات علم الجراثيم. لا يمكن تحديد منشئ هذا البروتوكول لأنه تم استخدامه وتحسينه من قبل العديد من الباحثين بمرور الوقت.

استخدام الطريقة المعروضة هنا في مختبراتنا منذ ما يقرب من عقدين من الزمن ، وهدفنا هو مشاركة هذا البروتوكول المفيد مع أقراننا. العرض المرئي لهذه الطريقة مهم لخطوة واحدة. على وجه الخصوص ، جمع البكتيريا من العشب على المثقاب لأن الأمر يتطلب عين خبرة لتقييم النمو على اللوحة.

وهذا هو أفضل تصور. توضح الإجراء السيدة تيريزا بروكس ، مساعدة باحثة من مختبر الدكتور تي كوسكي في جامعة ألبرتا في إدمونتون ، كندا. لبدء تحضير الثقافة البكتيرية في وقت متأخر من بعد الظهر ، استخدم كمية صغيرة من الإشريكية القولونية أو v coray لتلقيح واحد إلى خمسة ملليلتر من مرق الأوتوكلاف LB في أنابيب اختبار زجاج بو سيليكات معقمة.

اضبط أنابيب الاختبار الملقحة في أسطوانة أسطوانية واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية وسرعة عالية. قم بإعداد موزع خلية على شكل عصا هوكي من قضيب زجاجي عن طريق تسخين منتصف القضيب في لهب موقد بنسن حتى ينضج الزجاج. ثم استخدم الملقط أو الكماشة لتوجيه الانحناء برفق إلى زاوية 135 درجة.

قم بتسخين القضيب مرة أخرى عند نقطة المنتصف بين النهاية والانحناء الأول وثنيه بزاوية 45 درجة للداخل. تحضير رطل تهوية مع وبدون مضادات حيوية وتخزينها على أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي.

طبق 100 ميكرولتر من المزرعة الليلية على كل طبق أجار LB. باستخدام موزع الخلية ، احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى ست ساعات أو حتى يظهر عشب رقيق من نمو البكتيريا. باستخدام حلقة التلقيح ، قم بحصاد كتلة بكتيرية قطرها حوالي ملليمترين من اللوحة وتعليقها في مليلتر واحد من البرد الجليدي.

كلوريد الكالسيوم مللي مولار. في حالة استخدام الماء المقطر المزدوج أو الماء المقطر المعقم للقولونية باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد على أربع درجات مئوية ، قم بتدوير التعليق لمدة خمس دقائق عند 5 ، 000 Gs.تخلص من المادة الطافية وكرر الغسيل مرتين أخريين. بعد إزالة الحلقة الطافية النهائية ، قم بتعليق الحبيبات في 40 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم أو الماء المقطر بشكل مضاعف واستمر في وضع الثلج.

لإجراء التحويل ، أضف ما يصل إلى ميكروغرام واحد من الحمض النووي للبلازما إلى المعلق البكتيري 40 ميكرولتر ، وانقل الخليط إلى فجوة معقمة مبردة مسبقا تبلغ 0.2 سم. قم بإدخال vete في غرفة التثقيب الكهربائي لوحدة التحكم في النبض وتناول الطعام عند 1.8 كيلو فولت و 25 ميكرو ف. يجب أن يكون ثابت الوقت حوالي 5.0 مللي ثانية ويجب ألا يحدث انحناء.

أعد تعليق الخلايا بسرعة في ملليلتر واحد من مرق LB ونقلها إلى أنبوب اختبار زجاجي شواء الأوتوكلاف سابقا. اسمح للخلايا بالتعافي عن طريق الحضانة في ظل ظروف النمو الهوائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة دون اختيار المضادات الحيوية. ضع البكتيريا على ألواح LB ager مع المضادات الحيوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

كما هو موضح هنا ، قمنا بإجراء مجموعة من التحولات باستخدام e coli و V co array لمقارنة كفاءة التحويل لمنهجيتنا السريعة مع تكييف الطريقة التقليدية التي وصفها doer et al في الأصل لإعداد البكتيريا المختصة بالكهرباء. كان العائد المحول ضمن 10 من السادس إلى 10 من CFUs السابعة لكل ميكروغرام من نطاق الحمض النووي في ثلاثة ، تكرار التجارب ل e coli و v coray. استخدام الطريقة التقليدية للكفاءة الكهربائية.

إعداد الخلية ، انخفض العائد المحول عشرة أضعاف إلى 10 ، إلى الخامس ، إلى 10 إلى السادس CFUs لكل ميكروغرام من الحمض النووي في ثلاث تجارب مكررة ل e coli و v coray باستخدام الطريقة السريعة. لهذا السبب, حددنا النسبة المئوية للبكتيريا المحولة عن طريق قسمة CFUs المحولة على عدد CFUs التي تم استردادها من التحولات الوهمية من دفعات متطابقة من الخلايا المختصة. كانت النسبة المئوية للبكتيريا المحولة ضمن سجل واحد.

بغض النظر عن طريقة التحضير والأنواع المتحولة. تشير هذه النتائج إلى أن كفاءة الطريقة السريعة يمكن مقارنتها بتلك الخاصة بالإجراء التقليدي الأطول لإعداد الخلايا المختصة ، وأن السلالات التمثيلية ل IEO و coray و esia coli قابلة بنفس القدر للإجراء السريع. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمس إلى ست ساعات ، ويتم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر حصاد البكتيريا خلال مرحلة نموها اللوغاريتمي ، وغسلها في محلول ماء عازل معقم ومحضر حديثا ومبرد مسبقا وإبقائها باردة حتى يتم تعليقها في LB بعد التثقيب الكهربائي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد خلايا معينة من سلالة بكتيرية ذات كفاءة كهربائية بسرعة في مختبرك عن طريق زراعتها في العشب الافتتاحي ، وجمعها خلال المرحلة اللوغاريتمية من النمو ، ثم غسلها في مخزن مؤقت بارد استعدادا للتثقيب الكهربائي.