بروتوكول الأمثل لالكهربي التنقل التحول الفحص عن طريق أليغنوكليوتيد] وصفت صبغ الأشعة تحت الحمراء نيون

الهدف العام من هذا المقايسة هو الكشف عن التفاعلات بين البروتين والحمض النووي (DNA) باستخدام مجسات غير مشعة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية، مثل تحديد تسلسل الحمض النووي المستهدف للبروتينات. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها بديل سهل وآمن وموفر للوقت مقارنة باستخدام المجسات المشعة.

لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير هلام بولي أكريلاميد طبيعي بتركيز 5% يحتوي على 0.5x tris borate EDTA أو TBE، و2.5% glycerol باستخدام نظام هلام البروتين الصغير. لتحضير 30 مليلتر من محلول الهلام لأربعة أغشية هلامية، اخلط الماء المقطر، وTBE، وبيرسلفات الأمونيوم، وTEMED، والأكريلاميد بيس، وglycerol. قم بسكب محلول الهلام على الفور.

بعد عملية البلمرة، غلف الهلامات بغلاف بلاستيكي شفاف مبلل مسبقاً بمحلول 0.5x TBE واحفظها في درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد ذلك، صمم قليلاً من النيوكليوتيدات (oligonucleotide) طويل يتكون من 51 مرّاً (mers) تقريباً. صمم نيوكليوتيدات قصيرة مكملة تتكون من 14 مرّاً تقريباً مع تعديل بصبغة فلورية تعمل بالأشعة تحت الحمراء عند الطرف '5.

بمجرد تحضير قليلات النيوكليوتيد، أعد تعليقها في محلول Tris-EDTA المنظم بتركيز 1x لتصل إلى تركيز نهائي قدره 100 micromolar. ولإجراء عملية التلدين، اخلط 0.6 microliters من قليلة النيوكليوتيد القصيرة المصبوغة بصبغة five prime، و 1.2 microliters من قليلة النيوكليوتيد الطويلة، و 28.2 microliters من محلول sodium chloride Tris-EDTA المنظم في أنبوب سعة 1.5 milliliter. ضع الأنبوب في ماء مغلي لمدة خمس دقائق، ثم أوقف مصدر الحرارة واترك الماء الذي يحتوي على قليلات النيوكليوتيد الملدنة ليبرد طوال الليل في الظلام.

لتحضير مجسات DNA مزدوجة السلاسل، اخلط 30 µL من قليلات النوكليوتيد الملدنة مع DNTPs، ومحلول Klenow المنظم، وعلامة Klenow الصبغية للطرف 5'، وماء مقطر مزدوج في أنبوب PCR سعة 0.2 mL. حضن الخليط لمدة 60 دقيقة عند 37 °C في جهاز PCR. بعد ذلك، أضف 3.4 µL من EDTA بتركيز 0.5 M لإيقاف التفاعل، ثم قم بإبطال مفعول الإنزيم حرارياً عند 75 °C لمدة 20 دقيقة في جهاز PCR.

بعد ذلك، يتم تخفيف السلاسل المسبارية المعبأة باستخدام محلول sodium chloride Tris-EDTA المنظم لتصل إلى تركيز نهائي قدره 0.1 micromolar. تُحفظ قليلات النوكليوتيد عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius في الظلام حتى يحين وقت استخدامها. ولتحضير سلاسل مسبارية غير معلمة، يتم خلط 20 microliters من قليلة النوكليوتيد الطويلة، و20 microliters من قليلة النوكليوتيد Long R، و60 microliters من محلول sodium chloride Tris-EDTA المنظم في أنبوب سعة 1.5 milliliter.

ضع الأنبوب في ماء مغلي لمدة خمس دقائق، ثم أوقف تشغيل مصدر الحرارة واترك الماء الذي يحتوي على oligos الملدنة ليبرد طوال الليل. قم بتحضير واحد ملليلتر من 5x binding buffer عن طريق خلط Tris HCl، وSodium Chloride، وPotassium Chloride، وMagnesium Chloride، وEDTA، وDTT، وBSA، وماء مقطر مزدوج. قبل إعداد تفاعلات الارتباط، قم بتشغيل 5%native polyacrylamide gel مسبقاً في 0.5x TBE و2.5%glycerol لإزالة جميع آثار ammonium persulfate عند 80 فولت لمدة تتراوح من 30 دقيقة إلى ساعة واحدة، أو حتى يتوقف التيار عن التغير بمرور الوقت.

بعد ذلك، اخلط 4 µL من منظم الربط بتركيز 5x، و80 إلى 200 ng من البروتين A المنقى، و1 µL من مسبار مقترن بصبغة بتركيز 0.1 µM، وماء مقطر مزدوج. حضّن المزيج في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة. بعد التحضين، قم بتحميل كامل تفاعل الربط على الهلام وشغّل الهلام بجهد 10 volts/cm حتى المسافة المطلوبة.

غطِّ جهاز الفصل الكهربائي بالألومنيوم للحفاظ على الهلام في الظلام قدر الإمكان. نظف سطح الماسح الضوئي الخاص بنظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء باستخدام الماء المقطر. جفف الألواح الزجاجية التي تحتوي على الهلام ثم ضعها على سطح الماسح الضوئي.

افتح برنامج التصوير بالأشعة تحت الحمراء وانقر فوق علامة تبويب Acquire. بالنسبة للشرائح الأكثر سمكاً، استخدم الإعدادات التالية: 700 للقناة (channel)، و auto للشدة (intensity)، و 84 micrometers للدقة (resolution)، و medium للجودة (quality)، و 3.5 millimeters لإزاحة التركيز (focus offset). حدد المنطقة التي يشغلها الجل على الماسح الضوئي.

أخيرًا، انقر فوق Start لبدء عملية المسح. يمكن تتبع تقدم عملية الفصل الكهربائي باستخدام صبغة التحميل Orange G، بينما يتم اكتشاف صبغة Bromophenol blue أثناء المسح وبالتالي فإنها تتداخل مع تحليل الصور. أدت إضافة dI-dC إلى تفاعل الارتباط إلى إلغاء ارتباط 6xHis-SOX-2 المُنقى بمجسات DNA المصبوغة في الطرف الخماسي.

يعد الطافر LIM-4 والمسبار البارد SOX-2 الطافر في موقع ارتباط LIM-4 على نفس القدر من الكفاءة التي يتمتع بها المسبار البارد من النوع البري في التنافس مع المسبار المسمى بصبغة الفلورسنت بالأشعة تحت الحمراء للارتباط بـ 6xHis-SOX-2. ومع ذلك، فإن كفاءة التنافس للمسبار البارد الطافر LIM-4 وSOX-2 في موقع ارتباط SOX-2 أقل بكثير من المسبار البارد من النوع البري للارتباط بـ 6xHis-SOX-2. أدت اختبارات الإزاحة الفائقة (Supershift assays) لمعقد SOX-2 DNA باستخدامماصات 6xHis وflag إلى ظهور حزمة SOX-2 DNA مزاحة بشكل فائق.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إبقاء مجسات الأشعة تحت الحمراء في الظلام. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحرير الجينوم بتقنية CRISPR cas9 من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل أهمية تسلسل معين لربط DNA.

بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال الكيمياء الحيوية لاستكشاف التفاعلات بين البروتين وDNA في مختلف الكائنات النموذجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد التفاعلات بين البروتين وDNA باستخدام علامات DNA غير مشعة. لا تنسَ أن العمل مع الأكريلاميد يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.