الكشف عن وظيفية غير الترميز المتغيرات الوراثية عن طريق الكهربي التنقل التحول الفحص (EMSA) والحمض النووي تقارب الهطول الفحص (ضبا)

نقدم خطة وبروتوكولا استراتيجيا لتحديد المتغيرات الجينية غير المشفرة التي تؤثر على ربط الحمض النووي لعامل النسخ (TF). يتم توفير بروتوكول تجريبي مفصل لمقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA) وتحليل مقايسة ترسيب تقارب الحمض النووي (DAPA) لربط الحمض النووي TF المعتمد على النمط الجيني.

الهدف العام لهذه الاستراتيجية التجريبية هو التحقيق في وظائف المتغيرات غير المشفرة المرتبطة بالمرض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الجينوم ، مثل كيف أن المتغيرات الجينية التي لا تغير تسلسل الأحماض الأمينية في الواقع ، لا تزال تساهم في النمط الظاهري للمرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر عملية مبسطة لتقييم التباين الجيني لنشاط الوظيفة وتعطي نظرة ثاقبة للبروتينات التنظيمية والمسارات المؤثرة.

يمكن أن تفيد هذه التقنية في التحقيق في أي مرض مع متغير سببي مرشح. لأن إجراء تحليل هذه المتغيرات عالمي بغض النظر عن النمط الظاهري الذي تتم دراسته. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للأمراض التي تصيب الإنسان ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الطفرات في أي كائن حي.

سيتم تحضير المحللات النووية من الخلايا الأرومية الليمفاوية B في هذه التجربة ، ولكن يمكن تطبيق هذا الإجراء على معظم خطوط الخلايا. بعد عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، قم بتدوير العدد المطلوب من الخلايا للتحلل. استنشق الوسائط ، وأضف 10 مل من PBS المثلج ، وقم بتدوير الخلايا مرة أخرى.

اغسل الخلايا مرة ثانية باستخدام PBS ، وقم بإزالة PBS بعد الدوران. أعد تعليق حنك الخلية في PBS المثلج باستخدام مليلتر واحد من PBS لكل 10 إلى الخلايا السابعة. Aliquot مليلتر واحد من تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر ، بحيث يحتوي كل أنبوب على 10 إلى الخلايا السابعة في PBS.

جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين والشفط من PBS. أضف إلى مخزون العمل من المخزن المؤقت CE ، وواحد مليمولار ثنائي ثيوثريتول ، أو DTT ، ومثبط الفوسفاتيز 1X ، و 0.5 مللي مولار فينيل ميثان سولفونيل فلوريد ، أو PMSF. أعد تعليق كل لوحة خلية ب 400 ميكرولتر من هذا المخزن المؤقت ، واحتضن على الجليد لمدة 15 دقيقة.

أضف 25 ميكرولترا من 10٪ Nonidet P-40 إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق ، واخلطه عن طريق سحب العينات. جهاز طرد مركزي عند أربع درجات مئوية وسرعة قصوى لمدة ثلاث دقائق. صب وتخلص من الطافف.

بعد ذلك ، أضف إلى مخزون عامل من NE-buffer ، و DTT واحد مليمولار ، ومثبط فوسفواز 1X ، و PMSF واحد مليمول. أعد تعليق كل حنك خلية ب 30 ميكرولتر من هذا المخزن المؤقت ، واخلطه عن طريق الدوامة. احتضن عند 4 درجات مئوية ، في أنبوب دوار ، لمدة 10 دقائق.

جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين. اجمع المادة الطافية الصافية ، وهي المحللة النووية. قم بنقل المحللة النووية قبل تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لتجنب دورات الذوبان المتعددة بالتجميد التي قد تؤدي إلى تحلل البروتين.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد مخزون عمل 50 نانوموليا من قليل النوكليوتيد، كما هو موضح في نص البروتوكول. ضع oligos في كتلة حرارية على حرارة 90 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، قم بإيقاف تشغيل كتلة الحرارة واترك oligos يبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة على الأقل قبل الاستخدام.

بعد ذلك ، قم بإعداد مقايسة تحول الحركة الكهربية أو هلام EMSA. قم بإزالة الشريحة من جل ثلاثي البورات EDTA أو TBE مسبقة الصب ، أو ستة بالمائة ، واشطفها تحت الماء منزوع الأيونات عدة مرات لإزالة أي عازل من الآبار. قم بتجميع جهاز الرحلان الكهربائي للهلام ، وتحقق من وجود تسرب عن طريق ملء الغرفة الداخلية بمخزن مؤقت 0.5X TBE.

إذا لم يتسرب أي مخزن مؤقت إلى الغرفة الخارجية ، فاملأ الغرفة الخارجية ، تقريبا ، ثلثي الطريق. قم بتشغيل الجل مسبقا عند 100 فولت لمدة 60 دقيقة. عند اكتمال التشغيل المسبق ، اغسل كل بئر ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت 0.5X TBE.

قم بإعداد مزيج رئيسي للمخزن المؤقت الملزم. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، امزج هذه الكواشف المشتركة بين جميع التفاعلات. 10X مخزن مؤقت ملزم ، عديد سوربات DTT ، بولي (dI-dC) والحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون.

لإعداد تفاعلات EMSA ، أضف الماء الخالي من النوكلياز إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق ، بحيث يكون الحجم النهائي ، بعد إضافة جميع الكواشف ، 20 ميكرولترا. أضف الكمية المناسبة من المزيج الرئيسي إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف ثمانية ميكروغرامات من المحللة النووية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المناسبة.

قم بتضمين الأنابيب التي تحتوي على oligo ، بدون مستخلص نووي ، كعناصر تحكم سلبية. أضف 50 فيمتومول من oligo إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المناسبة ، ونقرها للخلط. قم بتدوير المحتويات لفترة وجيزة إلى أسفل الأنبوب.

احتضان جميع الأنابيب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من صبغة تحميل برتقالية 10X إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق. الماصة لأعلى ولأسفل للخلط.

قم بتحميل العينات في هلام TBE قبل التشغيل ، ستة بالمائة ، عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل للخلط ، ثم طرد كل عينة في بئر منفصل. قم بتشغيل الجل على حرارة 80 فولت لمدة 60 إلى 75 دقيقة تقريبا ، حتى تهاجر الصبغة البرتقالية من الثلثين إلى ثلاثة أرباع الطريق إلى أسفل الجل. عند اكتمال التشغيل ، استخدم سكين جل لفتح الكاسيت البلاستيكي.

قم بإزالة الجل من الكاسيت وضعه في وعاء به 0.5 بالمائة من عازلة TBE لمنعه من الجفاف. ضع الجل على سطح نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء والتلألؤ الكيميائي. تخلص من أي فقاعات أو ملوثات من شأنها تعطيل الصورة.

امسح الجل ضوئيا باستخدام برنامج نظام المسح الضوئي كما هو موضح في نص البروتوكول. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد مخزون عمل أوليغو بخمسة ميكرومولار كما هو موضح في نص البروتوكول. ضع oligos في كتلة حرارية على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد خمس دقائق ، قم بإيقاف تشغيل كتلة الحرارة واترك oligos يبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. قم بتسخين المخازن المؤقتة التالية إلى درجة حرارة الغرفة: مخزن مؤقت ملزم ، ومخزن غسيل منخفض الصرامة ، ومخزن غسيل عالي الصرامة ، ومخزن شطف. تحضير مخاليط الربط لكل متغير.

امزج حجما واحدا من المحللة النووية مع مجلدين من المخزن المؤقت الملزم. أضف مثبط الفوسفاتيز 1X ، و 0.5 مللي مولار PMSF ، ومحسن ربط 1X. أضف 10 ميكرولترات من خمسة ميكرومولار من الحمض النووي اللاتقط البيوتينيل إلى كل خليط ربط.

امزج عن طريق تحريك الأنبوب عدة مرات. احتضان مخاليط الربط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من حبيبات الستربتافيدين الدقيقة إلى كل خليط ربط.

احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لكل مسبار oligo يتم اختباره ، ضع عمود ربط في الفاصل المغناطيسي. تأكد من تسمية الأعمدة بالأوليغو المتغير الذي تم استخدامه في خليط الربط.

ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق مباشرة أسفل كل عمود ربط ، وقم بتطبيق 100 ميكرولتر من عازلة الربط لشطف العمود. ماصة محتويات كل خليط ربط في أعمدة منفصلة. اسمح للسائل بالتدفق بالكامل عبر العمود إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

ضع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل منخفض الصرامة على العمود وانتظر حتى يصبح خزان العمود فارغا. ضع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل منخفض الصرامة على العمود مرة أخرى. ضع 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل عالي الصرامة على العمود ، وانتظر حتى يفرغ خزان العمود.

ضع 100 ميكرولتر من عازلة الغسيل عالية الصرامة على العمود مرة أخرى. أضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت الأصلي للشطف إلى العمود واتركه لمدة خمس دقائق. أخيرا ، أضف 50 ميكرولترا إضافيا من المخزن المؤقت للشطف الأصلي لتخلص من عوامل النسخ المقيدة.

من أجل استكشاف قابلية تكرار نتائج EMSA ، وعواقب دورات ذوبان الجليد بالتجميد ، تم استخدام oligos التي تحتوي على الأليل المرجعي أو غير المرجعي لمتغير جيني لاستكشاف نفس المستحضر للمستخلص النووي للخلايا الليمفاوية البائية بعد دورات متعددة من التجميد والذوبان. يشير السهم الأزرق إلى المسبار الحر. ينظر إلى ارتباط عوامل النسخ بالقليغو على أنه شريط في النصف العلوي من الجل ، يشار إليه بالسهم الأحمر.

تشير هذه النتائج إلى أن تجميد وذوبان هذا المستخلص النووي المعين حتى خمس مرات ليس له ، على ما يبدو ، أي تأثير على سلامة البروتينات. من المهم أيضا تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ل EMSA. تم استخدام تركيزات مختلفة من oligos لاستكشاف مستحضر واحد من المحللة النووية.

لوحظت زيادة في شدة الفرقة ، ما يصل إلى 100 فيمتومول من oligo. تظهر هنا النتائج التمثيلية من دراسة أليل الخطر المرتبط بالذئبة. تم تحديد عامل النسخ ، STAT 1 ، لأول مرة بواسطة DAPA متبوعا بالتحليل البروتيني.

ثم أكدت لطخة غربية DAPA هوية STAT 1 ، والارتباط الأعلى للشكل الفسفوري ل STAT 1 بخطر الذئبة oligo. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تقنيات أخرى ، مثل قياس الطيف الكتلي واللطخة الغربية. سيساعدنا هذا في تحديد البروتين التنظيمي الذي يظهر الارتباط المعتمد على الأليل.

يمكن أيضا استخدام فحوصات المراسل مثل لوسيفيراز للتحقيق في التغيرات في التعبير الجيني كدالة للأليل.