التحول التنقل الكهربي الفحص (EMSA) لدراسة التفاعلات RNA-البروتين: حفيظة / IRP مثال

الهدف العام من التجربة التالية هو تحليل تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي من مستخلصات الخلايا باستخدام مقايسة تحول الحركة الكهربائية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير مستخلص البروتين أولا من الخلايا أو الأنسجة في خطوة منفصلة ، ويتم تصنيع وتنقية مسبار RNA للراديو الخاص بالجين. ثم يتم خلط مستخلص البروتين مع مسبار الحمض النووي الريبي المسمى للسماح بتكوين مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي المحددة.

أخيرا ، يتم تحميل منتج التفاعل على هلام بولي أكريلاميد غير متغير الطبيعة ويتم تحليله بواسطة مسبار الحمض النووي الريبي الخالي من الرحلان الكهربائي يتم فصله عن مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي بحكم حركته الأسرع. يستخدم مقايسة تحول الحركة الكهربية على نطاق واسع لتحليل تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي. يمكننا تحليل ارتباط البروتينات التنظيمية للحديد ، IRP واحد و IRP اثنين بعنصر الحمض النووي الريبي المستهدف.

ولكن يمكن أيضا تطبيق الطريقة لدراسة بروتينات ربط الحمض النووي الريبي الأخرى التي توضح أن هذا الإجراء سيتم إجراؤه بواسطة الدكتور كين ، الباحث الفلبيني المشارك في مختبري ، والدكتورة نيكول ويلكنسون ، زميلة ما بعد الدكتوراه للخلايا الملتصقة المزروعة في الأطباق. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS المثلج ، ثم أضف ملليلترا واحدا من PBS المثلج وحصاد الخلايا باستخدام مكشطة خلية بلاستيكية. انقل معلق الخلية السائبة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.

ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي دقيق أربع درجات مئوية مبرد مسبقا. قم بالدوران بسرعة منخفضة لمدة خمس دقائق واستنشق النفط. ستظهر الخلايا على شكل حبيبات بيضاء في الجزء السفلي من الأنبوب.

لكل 10 ملايين خلية يتم حصادها ، أضف 100 ميكرولتر من محلول تحلل السيتوبلازم المثلج. قم بفك حبيبات الخلية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات ثم احتضان التعليق على الجليد لمدة 20 دقيقة. سيؤدي ذلك إلى إذابة الغشاء الخلوي وإطلاق جميع محتويات العصارة الخلوية في المخزن المؤقت.

لعزل الجزء العصاري الخلوي المذاب ، قم بتدوير الأنبوب بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي بأربع درجات مئوية ، وانقل الأنبوب الموضح إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر على الجليد وتخلص من الحبيبات. بعد ذلك ، حدد تركيز البروتين الكلي لمستخلص السيتوبلازم الناتج باستخدام مقايسة برادفورد. ينقل المستخلص السيتوبلازمي الناتج في أنابيب أصغر ويخزن عند سالب 80 درجة مئوية حتى يستخدم لإنتاج مستخلصات سيتوبلازمية من الأنسجة الطازجة.

ابدأ عملية الحصاد بوضع القتل الرحيم على وسادة نظيفة فوق لوح تشريح. افتح البطن بالمقص. قم بإزالة الكبد والطحال باستخدام المقص والملقط.

اشطف كل منديل في حوالي 50 مل من PBS المثلج لمنع تدهور الأنسجة. قم بتقطيع الأنسجة على الفور إلى قطع صغيرة ، حوالي واحد إلى ملليمترين مكعبين باستخدام مشرط دون تأخير. ضع المناديل في أنبوب تبريد جديد وقم بتثبيته.

قم بتجميد عينة في النيتروجين السائل. قم بتخزين المناديل المجمدة على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الحاجة إليها. ابدأ في صنع المستخلص السيتوبلازمي عن طريق نقل عينة الأنسجة المجمدة مسبقا إلى أنبوب سعة ملليلتر بقاع مسطح يحتوي على 250 إلى 500 ميكرولتر من محلول التحلل المثلج.

ضع طرف مجانس الأنسجة في الأنبوب وقم بتشغيل الجهاز بقوة متوسطة. بعد 10 ثوان من التجانس ، ضع الأنبوب على الفور على الجليد لمدة 20 دقيقة لمنع تمسخ البروتين. لعزل الجزء العصاري الخلوي ، قم بتدوير الأنبوب بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي أربع درجات مئوية ، وانقل المادة الطافية المصفاة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر على الجليد وتخلص من الحبيبات.

تحديد تركيز البروتين الكلي للمستخلص السيتوبلازمي الناتج باستخدام مقايسة برادفورد. قم بتسخين المستخلص السيتوبلازمي الناتج في أنابيب أصغر وتخزينه عند سالب 80 درجة مئوية حتى تكون هناك حاجة إليه. قبل متابعة البروتوكول ، قم بإعداد طاولة عمل آمنة للإشعاع كاملة مع عداد جيجر لدرع زجاج شبكي.

قم بمراقبة علامات القياس الخلوي على معاطف المختبر والأدوات الحادة المناسبة الخاصة بالإشعاع وحاويات النفايات غير الحادة. بدءا من بلازميد الحمض النووي غير الخطي الذي يحتوي على عنصر استجابة الحديد المستنسخ. كقالب ، قم بإعداد تفاعل نسخ الحمض النووي الريبي في المختبر 20 ميكرولتر عن طريق خلط المخزن المؤقت لتفاعل القالب والنيوكليوتيدات المشعة جزئيا وبوليميراز الحمض النووي الريبي مع ماصة في درجة حرارة الغرفة.

لبدء تخليق الحمض النووي الريبي ، احتضان العينة عند 40 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بإنهاء تفاعل النسخ في المختبر عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من 0.5 مولي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0. امزج EDTA عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.

استخدم الآن بروتوكول قياسي لترسيب الكحول لتنقية منتج الحمض النووي الريبي. للبدء ، أضف 10 ميكرولترات من TRNA و 82.5 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم الثلاثة مولار عند درجة الحموضة 5.2 إلى خليط ما بعد التوليف والدوامة. لخلط TRNA ، سيعمل كناقل لهطول الأمطار وسيزيد من عائد الحمض النووي الريبي النهائي لترسيب الحمض النووي

أضف 273 ميكرولترا من 95 إلى 100٪ من الإيثانول واخلطها عن طريق الدوامة. اسمح لتفاعل هطول الأمطار بالمضي قدما عن طريق ترك الأنبوب على المقعد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لعزل الحمض النووي الريبي ، وتدوير الأنبوب لأسفل في جهاز طرد مركزي بدرجة حرارة الغرفة بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق. باستخدام الماصة ، تخلص من المادة الطافية بعناية ولا تزعج الحبيبات.

قد يوجد الحمض النووي الريبي المترسب إما على شكل حبيبات بيضاء صغيرة بالقرب من قاع الأنبوب أو قد يكون غير مرئي للعين المجردة. اغسل الحبيبات بإضافة 100 إلى 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول. قم بتدوير العينة بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم صب السنات بالغطاء.

افتح حبيبات الحمض النووي الريبي جافة عن طريق ترك الأنبوب مفتوحا على المقعد لمدة 10 إلى 15 دقيقة. أعد تكوين الراديو الصلب المسمى الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. حدد مدى دمج النيوكليوتيدات المشعة عن طريق وضع محلول الحمض النووي الريبي في عداد السائل Eloqua.

يقوم الراديو بتسمية مسبار الحمض النووي الريبي في أنابيب أصغر وتخزينه عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الحاجة إليه. يمكن استخدام الحصص المجمدة لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع قبل بدء مقايسة تحول الحركة الكهربية ، وقم بإعداد هلام أكريلاميد قياسي 6٪ غير متغير للطبيعة بحجم لا يقل عن 16 × 16 سم لتسهيل أحجام العينات الأكبر لكل حارة. ولتعزيز الاستقرار الميكانيكي للهلام بهذا الحجم.

استخدم فواصل زجاجية وأمشاط بسمك واحد على الأقل. لبدء مقايسة تحول الحركة الكهربية ، قم بإذابة المحللة السيتوبلازمية المجمدة مسبقا وتحقيقات الحمض النووي الريبي المسمى بالراديو على العينين بحثا عن مكون البروتين في التجربة. خفف 25 ميكروغراما من المستخلص السيتوبلازمي باستخدام المخزن المؤقت للتحلل السيتوبلازمي إلى حجم إجمالي نهائي يبلغ 10 ميكرولترات.

عند الحاجة ، أضف ميكرولتر واحدا من محلول مرق إلى الخليط واحتفظ بعينة البروتين على الثلج. بالنسبة لمكون الحمض النووي الريبي ، قم بتخفيف مسبار الحمض النووي الريبي المسمى بالراديو في الماء الخالي من النوكلياز حتى 200 ، 000 عد في الدقيقة لكل ميكرولتر حرارة لطبيعة الحمض النووي الريبي عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة وتبريد المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق على الأقل. لبدء تفاعل ربط الحمض النووي الريبي للبروتين ، أضف ميكرولتر واحدا من مسبار الحمض النووي الريبي المسمى بالراديو إلى مستخلص البروتين للسماح بالارتباط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

لزيادة خصوصية مقايسة تحول الحركة الكهربية ، أضف ميكرولتر واحد من مخزون الهيبارين إلى التفاعل. إذا كانت مجسات الحمض النووي الريبي ذات العلامات الإشعاعية أطول من 60 نيوكليوتيد ، أضف ميكرولتر إضافيا من الحمض النووي الريبي T واحد. اسمح لتفاعل الربط بالاستمرار لمدة 10 دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة لزيادة تعزيز الخصوصية والسماح بفصل أفضل لمركب بروتين الحمض النووي الريبي.

أضف ثلاثة ميكرولترات من عازلة التحميل والماصة لأعلى ولأسفل للخلط. ثم قم بتحميل التفاعل بالكامل على هلام الأكريلاميد 6٪ وقم بتشغيل الجل بخمسة فولت لكل سنتيمتر لمدة 60 دقيقة. تأكد من تغطية الجهاز بالحماية الإشعاعية المناسبة.

بفك جهاز الجل وانقل الجل إلى ورق ترشيح كبير. جفف الجل باستخدام جهاز تفريغ تجفيف الجل في غرفة مظلمة. ضع مزيج الجل وورق الترشيح فوق قطعة.

فيلم بعد التعرض ، قم بتطوير الفيلم وتجفيفه بالهواء. يمكن أن يختلف وقت التعرض الأمثل من ساعة إلى بين عشية وضحاها. يمكن للمرء تقييم قدرة الارتباط المعتمدة على الحديد ل I RRP واحد و I RRP اثنين لمجسات IRE المشعة في خلايا زراعة الأنسجة ذات المحتوى المتغير.

وبالتالي ، يتم تحفيز نشاط ربط IRE في الخلايا المستنفدة للحديد التي عولجت سابقا ب K لاحقا ديفيروكسامين. على العكس من ذلك ، يتم قمع نشاط ربط IRE في الخلايا المحملة بالحديد التي سبق معالجتها بالهيمان في الخلايا المحملة بالحديد. يفقد نشاط ربط IRE ل I RRP واحد بعد تجميع مجموعة كبريت الحديد بينما يخضع I RRP الثاني للتحلل المعتمد على الحديد.

يمكن تدمير مجموعة الخلايا الحديدية من IRP واحدة بمعالجة مقتطفات الخلية مع 2٪two me, مما يسمح برصد نشاط ربط IRE الخامل. لم يتم استرداد نشاط I RRP two من قبل اثنين أنا. في هذه التجربة التالية ، يتم تقييم أنشطة ربط IRE ل I RRP one و IRP two كدالة لتركيز الحديد الخلوي في سياق أنسجة الكبد الطازجة من النوع البري الأول RRP بالضربة القاضية و I RRP اثنين من الفئران بالضربة القاضية.

تظهر البيانات هنا أن تغذية الفئران بنظام غذائي غني بالحديد معروف بزيادة حمل الحديد الكبدي يعزز تقليل أنشطة ربط IRE ل I RRP one و IRP two في مستخلصات الكبد من الفئران البرية. أنا rrp اثنين من مجمعات IRE منحرفة بوجود I RRP واحد. يتم تصورها بسهولة في مستخلصات الكبد من I RRP فئران بالضربة القاضية.

هنا يؤدي النظام الغذائي عالي الحديد إلى تعطيل كامل لعملية المراجعة المستقلة الثانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي عن طريق مقايسة تحول الحركة الكهربية. تذكر أن جودة مسبار الحمض النووي الريبي أمر بالغ الأهمية للنجاح.