توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد موقع وهيكل حدث التكلس من خلال إجراء مجموعة من طرق الفحص المجهري البصري والإلكتروني. يتم تحقيق ذلك من خلال مراقبة دودة أنبوب اليرقات الحية أثناء التحول ، وهي مرحلة الحياة المسؤولة عن التكلس التي يمكن اكتشافها باستخدام مؤشرات الفلورسنت الحساسة لإشارات الأس الهيدروجيني والكالسيوم داخل الخلايا. يسمح لنا تصوير الأس الهيدروجيني داخل الخلايا بدراسة تركيز البروتون داخل وخارج السيتوبلازم في عملية التكلس.

للبدء ، تصوير الأس الهيدروجيني داخل الخلايا في يرقات دودة الأنبوب البحري ، يتم تلطيخ يرقات السباحة المختصة بصبغة مؤشر الأس الهيدروجيني داخل الخلايا ، SNARF-1 AM. ثم يتم نقل اليرقات إلى طبق من IBMX يحتوي على مياه البحر مع نافذة مراقبة زجاجية رقيقة وتوضع على مجهر فلوري ، حيث يتم اصطدامها بالضوء بطول موجي 488 نانومتر ، والذي تمتصه الصبغة. يتم جمع 580 نانومتر و 640 نانومتر من الصبغة. يمكن حساب قيم الأس الهيدروجيني داخل الخلايا من نسب هذه القيم.

يسمح لنا الفحص المجهري البصري بتحديد الوقت ومنطقة الأنسجة المرتبطة بمستوى أعلى من الأس الهيدروجيني. هذه هي الخطوة الأولى لتحديد النقاط الزمنية ذات الاهتمام لمزيد من التحليل. في الخطوة الثانية ، حافظ على دودة الأنبوب مع المثبتات في النقاط الزمنية ذات الصلة للفحص المجهري الإلكتروني.

يتم تحديد مرحلة حياة التمعدن حديثا باستخدام رسم خرائط SEM-EDS لإشارة الكالسيوم. ثم يتم فحص المناطق ذات إشارة الكالسيوم العالية باستخدام SEM / EBSD ، وتحديد وجود المعادن البلورية. أخيرا ، باستخدام شعاع أيوني مركز ، يتم قطع المعدن ، ويتم إعداد قسم رفيع لمراقبة TEM.

يستخدم هذا القسم للحصول على نمط حيود منطقة انتقائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية أو طرق الاختبار التقليدية مثل التحليل الطيفي لحيود الأشعة السينية السائبة هي أنها توفر ملاحظة مباشرة لهياكل محددة تمت ملاحظتها بواسطة طرق المجهر البصري والإلكترون ، وبالتالي ، يمكن دراسة أحداث التكلس المنفصلة مباشرة على المستويين الزمني والمكاني. عندما تتم دراسة التكلس باستخدام مؤشرات الكالسيوم والأس الهيدروجيني داخل الخلايا ، يمكننا تحديد الجدول الزمني لهذه الأحداث الفسيولوجية ذات الصلة.

الحفاظ على العينة في الوقت المناسب أمرا بالغ الأهمية لتحليل SEM المثمر. عند البحث عن الحدث الأول للتكلس البيولوجي ، يمكن استخدام SEM / EDX للكشف عن التوزيع الأولي للكالسيوم. قد يشير الموقع الذي يحتوي على المزيد من الكالسيوم إلى وجود كربونات الكالسيوم ، ومع ذلك ، فإن وجود نمط حيود الأشعة السينية فقط يمكن أن يؤكد وجود بنية بلورية.

يمكن الحصول على هذه المعلومات باستخدام EBSD و TEM. حيود التشتت الخلفي للإلكترون هو تقنية توصيف بلورية لتحديد المواد البلورية أو متعددة الكريستالات ، طالما أن البنية المجهرية وزاوية حركة العين السريعة للإلكترون تفي بحالة حيود براغ. عادة ، يتم جمع الإلكترونات المتناثرة مرة أخرى بإمالة بزاوية 70 درجة على عينة مصقولة مع خرائط اتجاه حبيبية أو بلورية.

بالنسبة لعينة غير مصقولة ، من الصعب إنشاء مثل هذه الخريطة من هذه الأسطح غير المستوية ، لأنه لا تفي جميع سلاسل الخدمة بمتطلبات زاوية EBSD. ومع ذلك ، في شكل نقطة IG ، لا يزال من الممكن جمع نمط حيود كاكوتشي من هذه الأسطح غير المستوية طالما تم استيفاء متطلبات زاوية EBSD. يوفر نمط حيود كاكوتشي تأكيدا لا لبس فيه على وجود المعدن البلوري.

طريقتنا مباشرة وسريعة ، ويمكن أن تنطوي على الأنسجة المعدنية الأخرى. هنا ، يتم استخدام شعاع أيوني مركز لتصنيع عينة دقيقة ، وهي أيضا طريقة مباشرة جدا لإعداد قسم TEM. لفحص عملية التحول ، تم استزراع الديدان الأنبوبية في المختبر لمدة خمسة أيام تقريبا.

سوف تسبح اليرقات المختصة في اتجاه أمامي بدلا من الحركة الدائرية. هذا يعني أنهم مستعدون للتحول. احتضان اليرقات المختصة في محلول الفلورسنت في مياه البحر ، وقم بتغطية الحاويات بورق الألمنيوم لمنع التبييض الضوئي واحتضان طوال الليل.

يتم غسل يرقات الدودة الأنبوبية على شبكة النايلون التي ستحتفظ باليرقات ولكنها تسمح للمحلول بالمرور. اغسل اليرقات بمياه البحر المفلترة مرتين لإزالة محلول الصبغة الزائد. اضغط على المصفاة على طبق بتري لإنشاء ختم محكم قبل تحرير الختم للتخلص من محلول الغسيل.

احرص على عدم تجفيف اليرقات. ثم ضع كل من 10 إلى 20 يرقة في طبق رفيع القاع الزجاجي مع IBMX وقم بتغطية الطبق حتى التصوير. بعد ذلك ، أدخل مكعبات المرشح المناسبة مع المرايا ثنائية اللون المناسبة للكشف عن إشارات الفلورسنت.

قم بتحسين وقت الغالق ليكون سريعا بما يكفي لالتقاط صور لكائن حي. بعد ذلك ، حدد معلمات التقسيم البصري على خيار Z-Stack ، وحرك المرحلة المجهرية لأعلى ولأسفل لتحديد موضع البدء والإيقاف للحصول على الصورة. اضبط مسافة ميكرومتر واحد بين الطبقات.

بعد التصوير ، قم بتصدير جميع البيانات كملفات TIF ذات تدرج رمادي. يمكن إجراء ذلك عن طريق تحديد ملف، تصدير. تأكد من ظهور أنواع الملفات كصور TIF، ثم انقر على "ابدأ".

الصورة ذات التدرج الرمادي في كل قناة ، في كل طبقة من Z-Stack في نفس مجلد الصورة جاهزا لتحليل الصور. أخيرا ، قم بإنشاء صورة مركبة لكل قناة من قنوات الفلورسنت ، باستخدام ImageJ. توضح مقاطع فيديو JoVE التالية كيفية إجراء معايرة وقياسات الأس الهيدروجيني داخل الخلايا.

الحفاظ على الديدان الأنبوبية التي تخضع للتحول باستخدام مثبت تشابك ، باستخدام محلول 4٪ بارافورمالدهيد في مياه البحر. ما عليك سوى خلط جزء واحد من 16٪ بارافورمالدهيد في ثلاثة أجزاء من مياه البحر والسماح للتثبيت طوال الليل. تخلص من المثبت الأساسي وأعد إصلاح العينة لمدة 30 دقيقة في محلول مائي من رابع أكسيد الأوزميوم بنسبة 1٪ لزيادة استقرار هياكل الأنسجة.

تأكد من العمل في غطاء الدخان والحصول على زجاجات نفايات منفصلة مكتوبة بوضوح ، وإعداد الفورمالديهايد ورباع أكسيد الأوزميوم. بعد ذلك ، قم بتجفيف العينات باستخدام سلسلة إيثانول متدرجة ، مما يسمح بخمس دقائق بين التغييرات. الخطوة التالية هي تجفيف العينات بمحلول 1: 1 من الإيثانول و HMDS ، وهو ما يكفي فقط لتغطية العينة.

انتظر حتى تتبخر العينة جافة في غطاء الدخان ، ثم كرر الإجراء باستخدام HMDS النقي. لإنشاء كسر متحكم فيه للعينة ، قم بتشغيل الشفرة الماسية على الطبق ، مع إحاطة عدد قليل من الأفراد لعمل قطع مثلث. مع تغطية طبق بتري ، ضع طبق الثقافة على كعب من الألومنيوم ، واضغط برفق لعمل كسر متحكم فيه.

لاحظ باستخدام مجهر التشريح ، والتقط بعناية قطعة كسر تحتوي على عدد قليل من الديدان الأنبوبية السليمة. باستخدام الطلاء الفضي ، قم بلصق العينة بحامل عينة SEM ، وقم بالطلاء حول الحواف بطلاء فضي لتقليل الشحن. العينة جاهزة الآن للتصوير لتحليل SEM-EDS.

أدخل العينة في الحامل في المجهر. قم بتوجيه العينة ووضع العينة أسفل عمود الإلكترون. قم بتحليل العينة ضمن وضع VP SEM.

تحسين التركيز والاستجماتيزم حسب الضرورة. حدد التكبير بحيث يملأ كائن حي واحد مجال الرؤية بالكامل. قم بتحليل التوزيع الأولي للكالسيوم على العينة من خلال الحصول على خريطة لمجال الرؤية بأكمله ، وقم بتشغيل الخريطة لمدة 15 دقيقة أو أكثر أو حتى تظهر البيانات توطين مميزا للكالسيوم داخل الكائن الحي.

للحصول على القياس الكمي للنقطة لمنطقة ذات اهتمام، حدد خيار معرف النقطة باستخدام أداة النقطة الواحدة. انقر فوق منطقة الاهتمام لإجراء الفحص. سجل الموقع بعناية عن طريق التقاط سلسلة من الصور بتكبير متناقص.

لتحضير العينات ل EBSD ، قم بإزالة العينة من حامل SEM المسطح وألصقها بكعب مائل مسبقا بزاوية 45 درجة باستخدام الطلاء الفضي. باستخدام صور SEM المرجعية ، حدد موقع محل الاهتمام والمنطقة الدقيقة للحيوان المراد فحصه. قم بإمالة المرحلة بمقدار 25 درجة بحيث يكون سطح العينة الآن حوالي 70 درجة إلى شعاع الإلكترون.

ارفع المسرح. حدد وضع EBSD في برنامج AZtec. اختر الأراجونيت كمراحل الاهتمام.

أدخل كاميرا EBSD ، واضبط ظروف الكاميرا لتحقيق إشارة تبلغ حوالي 90٪ باستخدام نقطية سريعة الشعاع ، احصل على خلفية ، ثم التقط صورة في Aztec. باستخدام أداة التحليل الموضعي ، انقر فوق موقع العينة التي أظهرت إشارة كالسيوم أعلى. امسح لمعرفة ما إذا كان قد تم اكتشاف أنماط كاكوتشي.

إذا كانت الأنماط موجودة وتطابق أيا من المراحل المحددة في قاعدة البيانات ، فهرستها تلقائيا. قم بحماية عينة SEM المحضرة بطبقة من البلاتين عن طريق طلاء الرش قبل الشروع في تحضير العينات الدقيقة باستخدام شعاع أيوني مركز. أدخل العينة في غرفة FIB SEM ، وقم بوضع العينة واحصل على صورة إلكترونية ثانوية حية ناتجة عن الأيونات.

حدد موقع منطقة الاهتمام من الصور المشار إليها كما تم تحديدها مسبقا بواسطة تخطيط EDS في EBSD. قم بتدوير المرحلة حسب الضرورة للحصول على الميزات ذات الأهمية بما يتماشى مع إطار النافذة ، واضبط التكبير لإظهار المنطقة لاستيعاب الميزات ذات الأهمية ، ثم حدد صندوقا لإيداع الكربون والتنغستن. التقط لقطة FIB ، ثم ارسم نمطا من أربعة صناديق حول غطاء التنغستن لتحديد موقع أخذ العينات المجهرية.

ثم قم بإمالة المرحلة عند 58 درجة واقطع الجزء السفلي من العينة الدقيقة. قم بإمالة المسرح مرة أخرى إلى الصفر ، وأدخل مسبار أخذ العينات المجهرية من التنغستن ، ثم قم بخفضه حتى يلامس العينة. قم بتوصيل مسبار التنغستن والعينة عن طريق إيداع التنغستن بين طرف المسبار وطلاء التنغستن ، ثم قم بإجراء القطع النهائي ، وافصل العينة الدقيقة عن بقية الجزيرة ورفع المسبار بعينة دقيقة مرفقة.

ضع نصف شبكة نحاسية TEM في حامل دخول جانبي ، وقم بخفض مسبار التنغستن حتى تتصل العينة الدقيقة بشبكة TEM. يتم طحن العينة الدقيقة بشكل أكبر حتى تصبح شفافة الإلكترون. قبل تحليل TEM ، املأ كلا الديوارين بالنيتروجين السائل واضبط الجهد المتسارع على 300 كيلو فولت.

ضع نصف الشبكة مع الصفائح المرفقة في حامل TEM القياسي. قم بتوسيط الشعاع على شاشة الفوسفور ، وقم بتقليص الحزمة وتوسيعها وتأكد من أن كل حركة الشعاع متحدة المركز. استخدم مقابض حركة المسرح للتنقل في العينة وتحديد موقعها، وزيادة التكبير على العينة وضبط Z-Height حتى تصبح العينة في نطاق التركيز البؤري.

استخدم العدسات البصرية حسب الضرورة. أدخل الكاميرا وقم بإزالة شاشة الفوسفور. قم بتوسيع الشعاع حسب الضرورة لتجنب تشبع الكاميرا.

اضبط التركيز ومعلمات الكاميرا لالتقاط صورة. للحصول على نمط حيود، قم بتوسيط الميزة ذات الاهتمام، وقم بإزالة فتحة الفتحة الموضوعية وأدخل فتحة الحيود. قم بالتغيير إلى وضع عدسة الحيود.

أدخل الفارغ لمنع مركز نمط الحيود من حرق الكاميرا أو شاشة الفوسفور. التقط صورة للنمط للتحليل البلوري. فيما يلي بعض الملاحظات لعملية التكلس أثناء تحول الدودة الأنبوبية.

زادت قيم الأس الهيدروجيني للديدان الأنبوبية بعد تحفيز IBMX للتحول وبدأ الرقم الهيدروجيني داخل الخلايا في الزيادة إلى ما بعد الثامنة في 31 ساعة. الأنسجة ذات الصلة بالتكلس هي منطقة الياقة. تظهر خريطة على إشارات SEM-EDS أن الدودة الأنبوبية في اليوم الأول كان لها توزيع متجانس للكالسيوم ، مما يشير إلى أن عملية التكلس لم تبدأ بعد.

بعد يومين من تحفيز التحول ، كانت بعض الديدان الأنبوبية قد تكلست بالفعل أكثر من اللازم ولم تعد مناسبة لمراقبة المواد المتكلسة حديثا. في عينة الدودة الأنبوبية ، مثل تلك المستخدمة في هذا المثال ، لا يزال التكلس في مراحله المبكرة ، لذلك ساعد القياس الكمي للكالسيوم في تحديد موقع الاهتمام لتوصيف وجود المعادن. عند فحصها باستخدام SEM-EBSD ، كان للمنطقة الموضعية ذات إشارة الكالسيوم القوية أيضا بنية بلورية من الأراجونيت.

باستخدام شعاع الأيونات المركز ، تم تحضير العينة ل TEM وتم تحليل نمط الحيود من معدن الأراجونيت بمزيد من التفاصيل البلورية بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد موقع حدث التمعدن في كائن حي متعدد الخلايا. عند استخدام المجهر البصري والإلكترون معا ، يمكننا الحصول على مستوى كبير من الفهم الفسيولوجي والمادي حول عملية التكلس.