خلايا الثدييات التغليف في أحجار الجينات باستخدام سفينة أثارت بسيطة

يصف هذا الفيديو طريقة لشل حركة خلايا الثدييات ، مثل جزر البنكرياس في حبات الجينات باستخدام وعاء بسيط مقلوب. مبدأ الطريقة هو توليد قطرات الجينات عن طريق مستحلب الماء والزيت ، متبوعا بالتبلور الداخلي لقطرات الألجينات. تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في توليد مستحلب حيث يتم تشتيت مرحلة مائية تحتوي على خلايا الجينات وكربونات الكالسيوم في مرحلة عضوية من الزيت المعدني.

الخطوة الثانية هي تحمض المستحلب عن طريق إضافة حمض قابل للذوبان في الزيت ، مثل حمض الخليك ، الذي ينقسم بسرعة إلى المرحلة المائية. يؤدي انخفاض الأس الهيدروجيني إلى إذابة كربونات الكالسيوم ، والهلام الداخلي لقطرات الجينات إلى حبات. تتمثل الخطوة الأخيرة في استعادة الخرزات من المستحلب عن طريق إضافة محلول مائي ، وفصل المراحل عن طريق الطرد المركزي ، متبوعا بغسل الخرزات وتصفيتها.

يمكن بعد ذلك زراعة الخلايا المجمدة في المختبر أو استخدامها للزرع. الطريقة التي وصفناها هي بديل لاستخدام مغلفات الخلايا القائمة على الفوهة لتوليد حبات الجينات. تم اشتقاق هذا من طريقة للإنزيمات وتثبيت الخلايا الميكروبية ، والتي تم الإبلاغ عنها لأول مرة من قبل Poncelet وآخرون في عام 1992.

التطبيق الذي يثير اهتمامنا أكثر هو تغليف الجينات كوسيلة لعزل الخلايا المزروعة مناعية ، وذلك لتقليل أو حتى القضاء على الحاجة إلى الأدوية المضادة للرفض. تتمثل المزايا الرئيسية للعملية القائمة على المستحلب على الأجهزة القائمة على الفوهة في قابليتها للتوسع وقوتها. نظرا لأن القطرات تتولد في وقت واحد تقريبا ، يمكن إنتاج كميات كبيرة جدا من الخرز في فترات زمنية قصيرة جدا ، إما من محاليل الجينات المخففة جدا أو شديدة التركيز.

علاوة على ذلك ، فإن العملية قوية للغاية ، وليست عرضة للفشل ، وحتى في وجود جزيئات يمكن أن تعيق الفوهات ، وأخيرا ، فإن معدات العملية بسيطة إلى حد ما وبالتالي فهي في متناول معظم المختبرات ، منخفضة التكلفة نسبيا. خطوات المعالجة الرئيسية هي الاستحلاب لتشكيل قطرات الجينات ، والتحمض لإطلاق مصدر الكالسيوم الداخلي. يتأثر حجم القطرة بشكل أساسي بتصميم المكره ومعدل التحريك ومدة التحريض.

تتأثر الخواص الميكانيكية للحبات وبقاء الخلية بمدى ومدة التحمض. في هذا الفيديو نوضح طريقة تستخدم لتغليف الخلايا في حبات الجينات بنسبة 5٪ للزرع. من المحتمل أن تتطلب هذه المعلمات تحسينا للتطبيقات المحتملة الأخرى.

لتوليد 5٪ حبات الجينات تحتوي على خليط نصف ونصف من الجينات LVM و MVG ، قم بوزن 583 ملليغرام LVM و 583 ملليغرام MVG مسحوق حمض الألجينيك. ضع 20 مليلتر من المخزن المؤقت للعملية على لوحة تحريك مغناطيسية. بالنسبة لتطبيقات الزرع ، نستخدم عازلة HEPES سعة 10 ملليمولار تحتوي على 170 مللي مولار كلوريد الصوديوم عند درجة الحموضة 7.4.

أضف مسحوق حمض الألجنيك تدريجيا إلى المحلول. اترك المحلول مع التحريك طوال الليل بسرعة منخفضة. إذا لزم الأمر ، اربط القارورة بلوحة التقليب.

في اليوم التالي ، إذا تم إذابة الجينات بشكل غير كامل ، اربط البرطمان في خلاط دوار واستمر في الخلط طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بمجرد إذابة الجينات تماما ، قم بتعقيم المحلول عن طريق التعقيم لمدة 30 دقيقة. اترك درجة الحرارة تنخفض إلى أقل من 50 درجة مئوية قبل فتح الأوتوكلاف.

قم بإعداد معلق كربونات الكالسيوم عن طريق إضافة جرام واحد من كربونات الكالسيوم إلى 20 مل من المخزن المؤقت للعملية. الأوتوكلاف معلق كربونات الكالسيوم والوعاء المقلوب المستخدم في عملية المستحلب. قبل الاستخدام ، قم بإزالة أي آثار للماء المكثف من الوعاء.

مباشرة قبل عملية المستحلب ، قم بإذابة 44 ميكرولتر من حمض الخليك الجليدي في 11 مليلتر من الزيت المعدني الموضوع في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. من الأخطاء الشائعة الذوبان غير الكامل لحمض الأسيتيك ، وتجنب سحب العينات بكميات أصغر من 10 ميكرولتر ، والتأكد من إذابة الحمض تماما عن طريق الدوامة المتكررة. اسمح لجميع المحاليل بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل الشروع في تغليف الخلية.

ضع 10 مل من الزيت المعدني في قارورة الدوار ، وابدأ في التقليب عند 250 دورة في الدقيقة. إذا تم استخدام الخلايا الملتصقة مثل خلايا بيتا tc3 ، فقم بتربسين الخلايا. قم بإنهاء التفاعل بإضافة وسيط كامل وأخذ عينة لتعداد الخلايا.

حدد تركيز الخلية يدويا أو باستخدام عداد خلية آلي. الطرد المركزي للخلايا لمدة سبع دقائق عند 300 جم ثم أعد تعليق منصة الخلية في وسط كامل. كرر خطوة الطرد المركزي ثم أعد تعليق الخلايا في الحجم المناسب من الوسط الكامل للحصول على 10 و 1/2 أضعاف التركيز النهائي المطلوب في الخرز.

انقل 9.9 مل من محلول الجينات إلى أنبوب مسطح القاع ، ثم أضف 1.1 ملليلتر من مخزون الخلايا ، و 550 ميكرولتر من تعليق كربونات الكالسيوم. امزج الألجينات وكربونات الكالسيوم وتعليق الخلية عن طريق دوامة خفيفة. انقل على الفور 10.5 مل من هذا الخليط إلى زيت التحريك باستخدام حقنة.

قم بزيادة معدل التحريك ثم ابدأ المؤقت. لتحديد معدل التحريض ، يجب أولا إنشاء منحنى قياسي يربط حجم الخرزة بمعدل التحريض. بعد 12 دقيقة أضف 10 ملليلتر من الزيت ومحلول حمض الأسيتيك لتحمض المستحلب ، وإطلاق الكالسيوم من الكربونات ، والحصول على حبات متبلورة.

اترك ثماني دقائق لخطوة التبلور الداخلية هذه. لاحظ تغير لون القطرات المستحلبة التي تحتوي على مؤشر الأس الهيدروجيني الأحمر الفينول. قلل معدل التحريك إلى 400 دورة في الدقيقة ، وقم بتحييد الحمض عن طريق إضافة 40 مل من المخزن المؤقت للعملية الممزوج بوسط 10٪ ، مما يؤدي إلى انعكاس الطور.

أوقف التحريك بعد دقيقة واحدة وانقل الخليط إلى أنابيب مخروطية. اشطف القارورة الدوارة بكمية إضافية من الوسط 20 مليلتر ، وأضفها إلى الأنابيب. استنشق أكبر قدر ممكن من المحلول المائي قبل شفط طور الزيت.

بالطرد المركزي للأنابيب لمدة ثلاث دقائق عند 630 جم لتسريع ترسيب الخرزة وفصل الطور. قم بإزالة الزيت ومخزن المعالجة الزائد عن طريق الشفط باستخدام ماصة باستور. اغسل الخرزات مرة واحدة على الأقل باستخدام 630 جم من الطرد المركزي بين الغسل.

قم بتصفية تعليق الخرزة على مصافي خلايا النايلون 40 ميكرون واستنشق السائل الزائد في المصفاة من الأسفل. انقل الخرزات إلى حجم معروف من الوسط باستخدام ملعقة. قم بقياس حجم الخرزة وقم بتعبئة الوسط للحصول على تركيز الخرزة المطلوب.

التركيز النموذجي هو حبات مليلتر واحد لكل خمسة مليلتر الحجم الإجمالي. من هذه النقطة فصاعدا، تعامل دائما مع الخرزات بماصات كبيرة التجويف لتجنب إتلاف الخرز. يمكن الآن نقل الخلايا المغلفة إلى قوارير T ، واستخدامها في الزراعة المختبرية أو الزرع.

في نهاية عملية المستحلب ، يجب الحصول على حبات الجينات التي تحتوي على خلايا ثابتة. بعد العملية ، يجب تقييم توزيع حجم الخرزة وبقاء الخلية بشكل روتيني. لتحديد توزيع حجم الخرزة ، يمكن تلطيخ الخرزات باللون الأزرق تولويدين ، متبوعا بتحليل الصور.

من المتوقع توزيع حجم الخرزة على نطاق واسع من هذه العملية. لتقييم بقاء الخلية ، يمكن تحضين الخرزات ببقع ميتة حية ، مثل الكالسيين AM وهوموديمر الإيثيديوم. باستخدام العملية الموضحة في هذا الفيديو ، تم قياس بقاء 76٪ من خلايا بيتا tc3.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية شل حركة خلايا الثدييات في حبات الجينات باستخدام نظام تقليب بسيط. يجب أن يكون البروتوكول الأساسي الموضح في هذا الفيديو مناسبا لشل حركة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا باستخدام مجموعة واسعة من أنواع الجينات والتكلسات. نوصي بإنشاء منحنى قياسي يربط متوسط حجم الخرزة بمعدل التحريض مع كل دفعة جديدة من الجينات أو الزيت.

تعد عملية الاستحلاب التي وصفناها بديلا واعدا لمغلفات الخلايا القائمة على الفوهة. إنها طريقة قوية وبسيطة لشل حركة خلايا الثدييات في حبات الجينات. بينما نقوم نحن وآخرون في جميع أنحاء العالم بتطوير علاجات الخلايا الفوهة ، ستكون هناك حاجة إلى مثل هذا النطاق من الأساليب لعدة آلاف من مرضى السكري.

لقد نشرنا نتائج واعدة من زرع خط خلايا بيتا في حبات الجينات بنسبة 5٪ ، ونواصل استكشاف الأداء في الجسم الحي لهذا الحاجز المحسن لرفض الزرع.