الخلوية الأكسدة التنميط باستخدام عالية المحتوى المجهري

الهدف العام من هذه الطريقة القائمة على المجهرية عالية المحتوى هو التحديد الكمي المتزامن للشكل والوظيفة الميتوكوندريا ومستويات أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية، وذلك لإنشاء بصمة أكسدة واختزال قوية لخطوط الخلايا المعرضة لاضطرابات تجريبية مختلفة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في بيولوجيا الأكسدة والاختزال، مثل ما إذا كانت الظروف الممرضة أو المعالجات بالمركبات تحفز الإجهاد التأكسدي، وإلى أي مدى يتأثر شكل ووظيفة الميتوكوندريا. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية قياس جميع المعلمات داخل الخلية نفسها وفي الوقت ذاته.

لبدء الإجراء، قم بزراعة من 8,000 إلى 10,000 خلية من الخلايا الليفية الجلدية البشرية في 60 بئراً داخلياً من لوحة سوداء ذات 96 بئراً ذات قاعدة رقيقة ومستمرة من البوليسترين أو الزجاج. عند استخدام ظروف أو معالجات أو خطوط خلوية مختلفة، قم بتوزيع مواقع زراعتها بشكل متجانس على اللوحة لتقليل تأثيرات اللوحة. بعد ذلك، ازرع 8,000 إلى 10,000 خلية إضافية في البئر B01 لاستخدامها في ضبط التركيز.

بعد ذلك، املأ الآبار الخارجية الفارغة بالوسط الغذائي لتقليل التدرجات بين الآبار والبيئة المحيطة. انقر بلطف على الطبق ثلاث مرات قبل إعادته إلى الحاضنة لمنع نمو الخلايا في بقع. استزرع الخلايا لمدة 24 ساعة، أو حتى تصل درجة التلاقي إلى 70%confluency.

بعد ذلك، احفظ معلومات المعالجة الخاصة بالتجربة في جدول بيانات يسمى setup. ولإعداد المجهر، قم أولاً بمعايرة منصة XY باستخدام البرنامج. بعد ذلك، أنشئ بروتوكول تصوير لصفيحة متعددة الآبار باستخدام برنامج الاستحواذ.

يتيح هذا البروتوكول الاستحواذ التلقائي لمواقع محددة وآبار مختارة من لوح يحتوي على 96 بئراً. الآن، اختر النوع الصحيح للوح متعدد الآبار من قائمة الألواح المتاحة المقدمة داخل البرنامج. بدلاً من ذلك، قم بتحديد تنسيق اللوح متعدد الآبار باستخدام أبعاد اللوح والبئر.

بعد ذلك، قم بمحاذاة لوحة الآبار عن طريق تحديد زاويتين من الآبار الأربعة الموجودة في الأركان الخارجية. عقب ذلك، اختر الآبار المراد تصويرها، وحدد بروتوكول اكتساب يتكون من اكتساب متسلسل للأطوال الموجية. تأكد من ضبط قناة GFP أولاً.

بعد ذلك، قم بتحديد حلقة لصفيحة الآبار لالتقاط أربع صور غير متداخلة وموزعة بانتظام ومتموضعة حول مركز كل بئر مختار باستخدام بروتوكول الالتقاط المحدد. في هذه الخطوة، قم بتحضير محلول التلوين لـ 60 بئراً عن طريق إضافة المحلول المخزون من CM-H2DCFDA وTMRM إلى منظم HBSS HEPES. بعد ذلك، تخلص من وسط الزرع من الخلايا عن طريق قلب الصفيحة رأساً على عقب بحركة سائلة واحدة.

اغسل الخلايا بلطف مرتين باستخدام منظم HH. لا تنسَ البئر A01 الذي يحتوي على الخلايا المستخدمة لضبط التركيز. تخلص من منظم HH بين خطوات الغسيل.

بعد ذلك، قم بتحميل الخلايا بـ CM-H2DCFDA و TMRM عن طريق إضافة 100 microliters من محلول الصبغ إلى كل بئر. ومرة أخرى، لا تنسَ البئر A01. قم بتحضين الخلايا لمدة 25 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

بعد مرور 25 دقيقة، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 100 µL من HH buffer وأضف 100 µL من HH buffer إلى جميع الآبار الداخلية الستون. ولإجراء القياس الفعلي، قم بتركيب الطبق على المجهر. بعد ذلك، قم بتشغيل نظام التركيز التلقائي المعتمد على الأجهزة واضبط إزاحة التركيز التلقائي باستخدام البئر B01 وقناة TMRM حتى تحصل على صورة حادة.

بعد ذلك، قم بتشغيل بروتوكول التصوير. ستوفر مجموعة بيانات الصور الناتجة معلومات حول مستويات ROS الأساسية، وجهد الغشاء الميتوكوندري، ومورفولوجيا الميتوكوندريا. بعد ذلك، ولقياس مستويات ROS المستحثة، قم بإزالة لوحة الـ 96 بئر بعناية من المجهر.

أضف 100 µL من محلول TBHP بتركيز 40 µM إلى كل بئر، وانتظر ثلاث دقائق على الأقل للسماح بالتفاعل الكامل لـ TBHP مع CM-H2DCFDA. خلال هذا الوقت، أضف 100 µL من محلول عمل الأجسام المضادة إلى البئر A01. الآن، قم بتثبيت الطبق مرة أخرى على المجهر وتحقق من التركيز مجدداً باستخدام البئر B01.

بعد ذلك، قم بالتقاط الصور لنفس المواضع التي تم تصويرها في جولة التصوير الأولى باستخدام بروتوكول التصوير نفسه. ستوفر مجموعة بيانات الصور الناتجة معلومات حول مستويات ROS المستحثة. بعد ذلك، قم بالتقاط صور الحقل المسطح (flat field images) في البئر A01.

تأكد من أن الإشارات تقع تماماً ضمن النطاق الديناميكي، وذلك عبر ضبط إعدادات الحصول على البيانات. بعد ذلك، قم بتصدير مجموعات البيانات المكتسبة في مجلد واحد كملفات TIFF فردية باستخدام تسميات معيارية.

يتضمن ذلك الإشارة إلى الطبق، وما إذا كان ذلك قبل أو بعد المعالجة بـ TBHP، والبئر، والحقل، والقناة، مفصولة بشرطات سفلية. كما يجب حفظ صور الحقل المسطح في المجلد نفسه كملفات TIFF فردية باستخدام التسمية الموحدة. في هذه الخطوة، افتح برنامج معالجة الصور وقم بتثبيت مجموعة وحدات الماكرو الخاصة بمقاييس الأكسدة والاختزال.

بعد ذلك، افتح واجهة الإعداد لضبط إعدادات التحليل من خلال النقر على الزر S. حدد نوع الصورة، وعدد القنوات، والبئر الذي استُخدم لالتقاط صور المجال المسطح (flat field images). بعد ذلك، حدد القناة التي تحتوي على الخلايا أو الميتوكوندريا.

قم بتفعيل مربعات الاختيار الخاصة بـ "التحقق من الخلفية" (background check) و"التحسين" (enhance) لإجراء عملية طرح الخلفية والمساواة التكيفية للمدرج التكراري المحدودة التباين على التوالي. بعد ذلك، حدد قيمة sigma للتنعيم الغاوسي (gaussian blurring) للخلايا والتحسين اللابلاسي (laplacian enhancement) للمتقدرات. اختر خوارزمية تحديد العتبة التلقائية وقم بتعبئة حدود استبعاد الحجم.

بعد ذلك، اختبر إعدادات التجزئة على بضع صور مختارة من مجموعات البيانات المكتسبة عن طريق فتحها والنقر على الزرين C أو M في القائمة لتجزئة الخلايا أو الميتوكوندريا على التوالي. عقب ذلك، قم بإجراء التحليل الدفعي على المجلد المطلوب من خلال النقر على زر الهاش (#) واختيار المجلد الذي يحتوي على الصور. تحقق من الإعدادات ثم اضغط موافق.

بعد تحليل الدفعة، تحقق بصرياً من أداء التجزئة على مجموعة تدقيق من خلال النقر على زر V واختيار المجلد الذي يحتوي على الصور. تصفح مجموعة التدقيق للتأكد مما إذا كانت عملية التجزئة قد تمت بنجاح. يتم إجراء التحليل الأولي للبيانات المستخرجة تلقائياً باستخدام تطبيق Shiny تكميلي.

يتيح ذلك تفسيراً سريعاً للنتائج. للبدء، افتح التطبيق في R Studio، ثم اختر تشغيله في متصفح خارجي.

في صفحة الإدخال، حدد المجلد الذي توجد به ملفات النتائج. تأكد من وجود ملف الإعداد في هذا المجلد أيضاً. سيتم استيراد ملفات النتائج ومعلومات الإعداد وتجميعها وتصويرها بيانياً بشكل تلقائي.

توضح صفحة الإعداد التجريبي مخطط التجربة. وتعرض الصفحة التالية مستويات ROS بالإضافة إلى العديد من المعايير الميتوكوندرية لكل لوحة على حدة. اختر اللوحة التي تريد عرضها باستخدام القائمة المنسدلة.

تُعرض البيانات بتنسيق لوحة متعددة الفجوات، بالإضافة إلى مخططات صندوقية مع تحديد القيم المتطرفة برقم الفجوة ورقم الصورة. وتُظهر صفحة نتائج التجربة الكاملة النتائج المعيارية لجميع اللوحات مجتمعة، إلى جانب تحليل إحصائي أساسي. وفي حال تقديم ملف استبعاد عبر صفحة الإدخال، سيتم استثناء نقاط البيانات المحددة.

في صفحة تحليل العنقودية، يتم تكوين ملف تعريف أكسدة واختزال حساس باستخدام المكون الرئيسي والتحليل بناءً على بيانات من خمسة عوامل. وأخيراً، تتيح صفحة تنزيل البيانات حفظ البيانات المعالجة والمعاد ترتيبها لاستخدامها لاحقاً. تظهر هنا النتائج من تجربة عولجت فيها الخلايا الليفية الجلدية البشرية بمثبط بروتياز HIV وهو Saquinavir.

باستخدام البروتوكول الموصوف، تم اكتشاف زيادة ملحوظة في مستويات ROS الأساسية والمحفزة على حد سواء، وذلك مقارنة بالخلايا الضابطة المعالجة بـ DMSO. كما أثر Saquinavir بشكل ملحوظ على المورفولوجيا والوظيفة الميتوكوندرية.

ازداد جهد الغشاء الميتوكوندري المقاس كمتوسط إشارة TMRM لكل بكسل ميتوكوندري بشكل ملحوظ. بالإضافة إلى ذلك، اكتسبت الميتوكوندريا نمطاً شديد التجزؤ، وهو ما أشارت إليه كمياً زيادة الدائرية وصغر متوسط حجم الميتوكوندريا الفردية. وعند دمج المعايير المذكورة أعلاه باستخدام تحليل المكونات الرئيسية، أمكن الفصل بوضوح بين حالتي التحكم وSaquinavir من خلال بصمات الأكسدة والاختزال الخاصة بكل منهما.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الإضاءة في حد ذاتها تسبب إجهاداً تأكسدياً. لذا، يجب تقليل ظروف التعرض للإضاءة والحفاظ عليها ثابتة طوال التجربة. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن صبغ واكتساب البيانات لما يصل إلى 20 طبقاً من نوع 96 well plates في يوم واحد.

بعد جولة التصوير الثانية، يمكن تثبيت الخلايا واستخدامها في صبغ مناعي فلوري لاحق. يزيد هذا من عدد المعلمات المقاسة على الخلايا ذاتها، ويسمح بالإجابة على أسئلة إضافية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على إجراء القياسات المدمجة لـ ROS والوظيفة المورفولوجية للميتوكوندريا في مزارع الخلايا الملتصقة باستخدام المجهر عالي المحتوى.