الخلوية الأكسدة التنميط باستخدام عالية المحتوى المجهري

الهدف العام لهذه الطريقة القائمة على الفحص المجهري عالي المحتوى هو تحديد وظيفة المومورفون للميتوكوندريا والمستويات الخلوية لأنواع الأكسجين التفاعلية في وقت واحد من أجل إنشاء بصمة أكسدة واختزال قوية لخطوط الخلايا المعرضة لاضطرابات تجريبية مختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الأكسدة والاختزال مثل ما إذا كانت الحالات المسببة للأمراض أو العلاجات المركبة تثير الإجهاد التأكسدي ، وإلى أي مدى يتأثر شكل الميتوكوندريا ووظيفتها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن قياس جميع المعلمات داخل نفس الخلية في نفس الوقت.

لبدء الإجراء ، قم بزرع ثمانية إلى 10،000 من الخلايا الليفية الجلدية البشرية في 60 بئرا داخليا من صفيحة بئر سوداء 96 مع بوليسترين رقيق مستمر أو قاع زجاجي. عند استخدام ظروف أو علاجات أو خطوط خلايا مختلفة ، قم بتوزيع مواقع البذر بشكل متجانس على اللوحة لتقليل تأثيرات اللوحة. بعد ذلك ، قم بزرع ثمانية إلى 10 ، 000 خلية أخرى في البئر B01 لاستخدامها لتعديل التركيز.

بعد ذلك ، املأ الآبار الخارجية الفارغة بوسط لتقليل التدرجات بين الآبار والبيئة. اضغط برفق على اللوحة ثلاث مرات قبل وضعها مرة أخرى في الحاضنة لتجنب نمو الخلايا في بقع. استزراع الخلايا لمدة 24 ساعة ، أو حتى تصل إلى 70٪ التقاء.

بعد ذلك، احفظ معلومات العلاج للتجربة في جدول بيانات يسمى الإعداد. لإعداد المجهر، قم أولا بمعايرة المرحلة XY باستخدام البرنامج. بعد ذلك ، قم بإنشاء بروتوكول تصوير للوحة متعددة الآبار باستخدام برنامج الاستحواذ.

يسمح هذا البروتوكول بالاستحواذ التلقائي على المواضع المحددة والآبار المختارة للوحة 96 بئر. الآن ، حدد النوع الصحيح من لوحة الآبار المتعددة من قائمة اللوحات المتاحة المتوفرة داخل البرنامج. بدلا من ذلك ، حدد تنسيق لوحة الآبار المتعددة باستخدام أبعاد اللوحة والبئر.

بعد ذلك ، قم بمحاذاة لوحة البئر عن طريق تحديد زاويتين من آبار الزاوية الخارجية الأربعة. بعد ذلك ، حدد الآبار التي يجب الحصول عليها ، وحدد بروتوكول الاستحواذ الذي يتكون من اكتساب الطول الموجي المتسلسل. تأكد من ضبط قناة GFP أولا.

بعد ذلك ، حدد حلقة لوحة البئر للحصول على أربع صور متباعدة بانتظام بدون تداخل موضوعة حول مركز كل بئر محدد باستخدام بروتوكول الاستحواذ المحدد. في هذه الخطوة ، قم بإعداد محلول التلوين ل 60 بئرا عن طريق إضافة محلول مخزون CM-H2DCFDA و TMRM إلى المخزن المؤقت HBSS HEPES. بعد ذلك ، تخلص من وسط الثقافة من الخلايا عن طريق قلب اللوحة رأسا على عقب بحركة سائلة واحدة.

اغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام عازلة HH. لا تنس جيدا A01 مع الخلايا المستخدمة لضبط التركيز. تخلص من المخزن المؤقت HH بين خطوات الغسيل.

بعد ذلك ، قم بتحميل الخلايا باستخدام CM-H2DCFDA و TMRM عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول التلوين إلى كل بئر. مرة أخرى ، لا تنس جيدا A01. احتضان الخلايا لمدة 25 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

بعد 25 دقيقة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من عازلة HH وأضف 100 ميكرولتر من عازلة HH إلى جميع البئرة الداخلية البالغ عددها 60. لإجراء القياس الفعلي ، قم بتثبيت اللوحة على المجهر. بعد ذلك ، قم بتشغيل نظام التركيز البؤري التلقائي المستند إلى الأجهزة واضبط إزاحة التركيز التلقائي باستخدام البئر B01 وقناة TMRM حتى تحصل على صورة حادة.

بعد ذلك ، قم بتشغيل بروتوكول التصوير. ستوفر مجموعة بيانات الصورة الناتجة معلومات عن مستويات ROS القاعدية ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، ومورفولوجيا الميتوكوندريا. بعد ذلك ، لقياس مستويات ROS المستحثة ، قم بإزالة لوحة البئر 96 بعناية من المجهر.

أضف 100 ميكرولتر من محلول TBHP عند 40 ميكرومولار لكل بئر وانتظر ثلاث دقائق على الأقل للسماح بالتفاعل الكامل ل TBHP مع CM-H2DCFDA. خلال هذا الوقت ، أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل الجسم المضاد إلى البئر A01. الآن ، قم بتركيب اللوحة مرة أخرى على المجهر وتحقق من التركيز مرة أخرى باستخدام البئر B01.

بعد ذلك ، احصل على نفس المواضع كما في جولة التصوير الأولى باستخدام نفس بروتوكول التصوير. وستوفر مجموعة بيانات الصور الناتجة معلومات عن مستويات أنواع الأكسجين المستحثة. بعد ذلك ، احصل على صور المجال المسطح في البئر A01.

تأكد من أن الإشارات ضمن النطاق الديناميكي. عن طريق ضبط إعدادات الاستحواذ. بعد ذلك ، قم بتصدير مجموعات البيانات المكتسبة في مجلد واحد كملفات TIFF فردية باستخدام التسميات الموحدة.

يتضمن ذلك الإشارة إلى اللوحة ، قبل أو بعد معالجة TBHP ، البئر ، الحقل ، والقناة مفصولة بشرطة سفلية. أيضا ، احفظ صور الحقل المسطح في نفس المجلد مثل ملفات TIFF الفردية باستخدام التسمية الموحدة. في هذه الخطوة ، افتح برنامج معالجة الصور وقم بتثبيت مجموعة ماكرو مقاييس الأكسدة والاختزال.

بعد ذلك ، افتح واجهة الإعداد لتعيين إعدادات التحليل بالنقر فوق الزر S. حدد نوع الصورة وعدد القنوات والبئر الذي تم استخدامه للحصول على صور الحقل المسطح. بعد ذلك ، حدد القناة التي تحتوي على خلايا أو ميتوكوندريا.

تحقق من مربعات الاختيار في الخلفية وتحسين الخلفية لإجراء طرح الخلفية ومعادلة الرسم البياني التكيفي المحدود على التوالي. بعد ذلك ، حدد سيجما للغاوسي وطمس الخلايا وتعزيز الميتوكوندريا. حدد خوارزمية تحديد العتبة التلقائية واملأ حدود استبعاد الحجم.

بعد ذلك ، اختبر إعدادات التجزئة على عدد قليل من الصور المحددة لمجموعات البيانات المكتسبة عن طريق فتحها والنقر فوق أزرار C أو M في القائمة لتجزئة الخلية أو الميتوكوندريا على التوالي. بعد ذلك ، من تحليل الدفعات في المجلد محل الاهتمام بالنقر فوق زر التجزئة وتحديد المجلد الذي يحتوي على الصور. تحقق من الإعدادات واضغط على موافق.

بعد تحليل الدفعات ، تحقق بصريا من أداء التجزئة على مكدس التحقق بالنقر فوق الزر V وتحديد المجلد الذي يحتوي على الصور. انتقل إلى مكدس التحقق لتأكيد ما إذا كان التقسيم ناجحا أم لا. يتم إجراء التحليل الأولي للبيانات المستخرجة تلقائيا باستخدام تطبيق لامع مجاني.

هذا يسمح بالتفسير السريع للنتائج. للبدء ، افتح التطبيق في R Studio. اختر تشغيله في مستعرض خارجي.

في صفحة الإدخال، حدد الدليل حيث توجد ملفات النتائج. تأكد من وجود ملف الإعداد أيضا في هذا الدليل. يتم استيراد ملفات النتائج ومعلومات الإعداد وتجميعها وتصورها تلقائيا.

تعرض صفحة الإعداد التجريبي تخطيط التجربة. تعرض الصفحة التالية مستويات ROS بالإضافة إلى العديد من معلمات الميتوكوندريا لكل لوحة على حدة. حدد اللوحة التي تريد تصورها باستخدام القائمة المنسدلة.

يتم عرض البيانات في شكل لوحة متعددة الآبار ، وكذلك في مخططات صندوقية مع قيم متطرفة مصنفة بئر ورقم صورة. تظهر صفحة تجربة النتائج بأكملها النتائج الطبيعية من جميع اللوحات مجتمعة ، جنبا إلى جنب مع التحليل الإحصائي الأساسي. إذا تم توفير ملف إسقاط من خلال صفحة الإدخال ، استبعاد نقاط البيانات المحددة.

في صفحة تحليل نظام المجموعة ، يتم تكوين ملف تعريف الأكسدة والاختزال الحساس باستخدام مكون رئيسي وتحليل البيانات من خمس معلمات. أخيرا ، تسمح صفحة تنزيل البيانات بحفظ البيانات المعالجة والمعاد ترتيبها لمزيد من الاستخدام. تظهر هنا نتائج تجربة عولجت فيها الخلايا الليفية الجلدية البشرية بمثبط إنزيم البروتياز لفيروس نقص المناعة البشرية ساكوينافير.

باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم الكشف عن زيادة كبيرة لكل من مستويات ROS القاعدية والمستحثة. بالمقارنة مع الخلايا الضابطة, تعامل مع DMSO. أثر ساكوينافير أيضا بشكل كبير على الوظيفة مورفو للميتوكوندريا.

زادت إمكانات غشاء الميتوكوندريا المقاسة كمتوسط إشارة TMRM لكل بكسل الميتوكوندريا بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، اكتسبت الميتوكوندريا نمطا مجزأ للغاية ، يشار إليه كميا بدائرية أعلى ومتوسط حجم أصغر للميتوكوندريا الفردية. عند الجمع بين المعلمات المذكورة أعلاه باستخدام تحليل المكونات الأساسية ، يمكن فصل كل من ظروف التحكم و Saquinavir بوضوح عن بعضها البعض من خلال بصمات الأكسدة والاختزال.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الإضاءة نفسها تسبب الإجهاد المؤكسد. لذلك ، يجب تقليل ظروف التعرض والحفاظ على ثباتها طوال التجربة. بمجرد إتقانها ، يمكن تلطيخ ما يصل إلى 20 96 لوحة بئر والحصول عليها في يوم واحد.

بعد جولة التصوير الثانية ، يمكن تثبيت الخلايا واستخدامها في تلطيخ الفلورسنت المناعي. يؤدي ذلك إلى زيادة عدد المعلمات المقاسة في نفس الخلايا بالضبط ، ويسمح بالإجابة على أسئلة إضافية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على إجراء القياسات المجمعة ل ROS ووظيفة مورفو الميتوكوندريا في مزارع الخلايا الملتصقة باستخدام الفحص المجهري عالي المحتوى.