تصحيح شريحة المشبك تقنية لتحليل اللدونة المستحثة بالتعلم

مرحباً، اسمي داي ميتسوشيما. سنوضح لكم هنا كيفية تحضير شرائح دماغية من حيوانات مدربة من خلال مقارنة بيانات تثبيت الرقعة (patch clamp) في حيوانات غير مدربة. وبذلك يمكننا تحليل اللدونة التشابكية الناتجة عن التعلم.

مرحباً، اسمي هيرويوكي كيدا. في هذه التجربة، بحثنا في الآلية العصبية للجري الحركي باستخدام اختبار Rotarod. يُستخدم اختبار Rotarod على نطاق واسع لتقييم الإدراك الحركي لدى القوارض.

تكمن ميزة هذه الطريقة في قدرتنا على تغيير مستوى الاكتشاف أثناء الاختبار عن طريق زيادة سرعة الدوران. اختبار قضيب الدوران. قبل البدء في المهمة الحركية، يجب ضبط جهاز قضيب الدوران على وضع التسريع من 4 إلى 40 rpms خلال 300 ثانية.

أُجريت عشر محاولات لكل اختبار للجرذان، وكان الفاصل الزمني بين المحاولات 30 ثانية. وخلال جلسة التدريب الأولى، تسقط الجرذان عادةً من فوق القضيب، حتى في السرعات المنخفضة، وأحياناً تسير في الاتجاه الخاطئ.

ومع ذلك، بعد تكرار التدريب، يمكن للجرذ المشي بسرعة أعلى. ومن خلال قياس فترة الكمون على القضيب، يمكننا تقدير أداء الجرذ في تعلم هذه المهارة. نرى هنا نتائج اختبار قضيب الدوران.

كما هو موضح في هذا الشكل، فإن يومين من التدريب كافيان لاكتساب المهارة الحركية. وبالمقارنة مع فترة الكمون في التجربة الأولى، أظهر التحليل البعدي تحسناً ملحوظاً في التجربة النهائية من أيام التدريب. ومن خلال قياس فترة الكمون على القضيب، يمكننا تقدير أداء التعلم للمهارة لدى الجرذ.

بعد ذلك، سنعرض لكم اختبار تجنب التثبيط. يفيد هذا الاختبار في تحليل أداء التعلم السياقي. يتكون جهاز تجنب التثبيط من جانبين، أحدهما مضاء والآخر مظلم، يفصل بينهما باب سقاطة.

خلال جلسة التدريب، توضع الجرذان في المنطقة المضاءة ويُمنح وقت قصير للتأقلم مع البيئة. وبمجرد فتح الباب، تكون الجرذان حرة في دخول المنطقة المظلمة حسب رغبتها. وعند دخولها إلى المنطقة المظلمة، يُغلق الباب وتتعرض الجرذان لصدمة كهربائية خفيفة لمدة ثانيتين.

بعد إعادتهم إلى أقفاصهم لمدة 30 دقيقة عند انتهاء التجربة، توضع الجرذان في المنطقة المضيئة من الجهاز مرة أخرى. وبعد مرور ثلاثين دقيقة من الصدمة، أظهرت الجرذان المدربة باستمرار فترة زمنية أطول قبل دخول المنطقة المظلمة. وهنا يمكننا رؤية نتائج اختبار التجنب التثبيطي.

بعد الصدمة الكهربائية، تعلمت الجرذان تجنب المنطقة المظلمة والبقاء في الجانب المضيء، وهو الجانب الذي لا تفضله في الحالة العادية. ويشير هذا الميل لتجنب الجانب المظلم إلى اكتساب ذكريات سياقية. شرائح الدماغ بعد التدريب.

قبل إجراء الشق، نقوم بتبريد جميع المقصات والملاقط المرقئة والكؤوس باستخدام الثلج المجروش. يمكنك هنا رؤية تحضيراتنا لعملية التشريح. يجب إجراء تشريح الدماغ بأسرع وقت ممكن.

بعد التخدير العميق، يوضع الجرذ في صينية ضحلة تحتوي على ثلج مجروش، ويُجرى شق لفتح التجويف البطني. وبعد شق الحجاب الحاجز، يتم إجراء شق جانبي إضافي. ولفتح التجويف الصدري، يجب إغلاق الغضروف الضلعي باستخدام ملقط شرياني (hemostat).

بعد كشف القلب، يتم إدخال إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ عيار 18 في الجزء الخلفي من البطين الأيسر. ويجب أن يكون طرف الإبرة مرئياً من خلال جدار الأبهر. وبعد قص الأذينة اليمنى، يبدأ التروية.

تأكد من ملء كل من الإبرة والمحقنة أولاً بمحلول عازل للتشريح مبرد بالثلج ومشبّع بالغاز. كما يجب إزالة أي فقاعات هوائية قبل عملية التروية. أولاً، قم بالقص عند الجزء الخلفي من الجمجمة.

بعد ذلك، قم بإجراء قطع جانبي، يليه قطع مركزي لكشف الدماغ. عند التشريح، يجب وضع الدماغ في محلول منظم مُبرد بالثلج مع التقليب لمدة خمس دقائق. وقبل البدء في عملية التشريح، يجب ترطيب ورقة الترشيح باستخدام محلول منظم مُبرد بالثلج.

بعد ذلك، يتم وضع الدماغ على منصة من الفولاذ المقاوم للصدأ المبردة بالثلج. وتعتبر زاوية منصة القطع أمراً بالغ الأهمية لضمان زاوية قطع صحيحة لشريحة الدماغ؛ حيث أن الزاوية غير الصحيحة قد تؤدي إلى قطع العصبونات الهرمية المستهدفة.

بعد التشذيب، يجب وضع قطرة واحدة من الغراء الفائق (superglue) على منصة جهاز الـ vibratone. ولضمان الالتصاق المحكم، يجب إزالة فائض محلول التشريح باستخدام قطعة من ورق الترشيح. وباستخدام جهاز الـ vibratone، يمكن عمل شرائح دماغية رقيقة مع الحفاظ عليها في محلول منظم بارد جداً ومُكثّر بالفقاعات.

منطقتنا المستهدفة هي القشرة الحركية الأولية. يمكن قص المنطقة المستهدفة من الدماغ باستخدام مقصات آيريس. ويمكن صنع غرفة الواجهة باستخدام حاوية طعام بلاستيكية.

يعد غطاء غرفة الواجهة ضرورياً لاحتواء الغاز. ويتم فحص الشرائح باستخدام مجهر الأشعة تحت الحمراء ذات التباين التفاضلي (infrared-DIC). وهنا يمكننا رؤية مثال للعصبونات في الطبقتين 2/3 في القشرة الحركية الأولية.

تُملأ ماصات تسجيل الرقعة (Patch recording pipettes) بالمحلول داخل الخلوي المناسب. يختلف المحلول المستخدم لتحليل تثبيت التيار (current clamp analysis) عن ذلك المستخدم لتحليل تثبيت الجهد (voltage clamp analysis). نتائج ممثلة.

تعتبر تقنية تثبيت التيار (current clamp) مفيدة لتحليل الخصائص الجوهرية للخلايا. بعد التدريب على قضيب الدوار (Rotor rod)، تمكنا من الحصول على بيانات تثبيت التيار من عصبونات الطبقة 2/3 في القشرة الحركية الأولية. يشير اللوح A إلى آثار نموذجية ناتجة عن حقن التيار.

يوضح اللوح B العلاقة بين التيار المحقون وعدد النبضات. وقد استحثت الجرذان المدربة لمدة يوم واحد نبضات أقل، بينما استحثت الجرذان المدربة لمدة يومين نبضات أكثر بكثير من الجرذان غير المدربة. وكما يتضح في الألواح السفلية، أظهرت الجرذان المدربة لمدة يوم واحد جهد راحة أقل، وعتبة نبض أعلى، وفرط استقطاب لاحق أكثر عمقاً.

أظهرت الجرذان التي خضعت للتدريب لمدة يومين جهد راحة ومقاومة غشائية أعلى. تُعد تقنية تثبيت الجهد (voltage clamp) مفيدة لتحليل اللدونة التشابكية الناجمة عن التعلم. وهنا، يمكننا رؤية البيانات الخاصة بعصبونات CA1 بعد التدريب السياقي.

حصلنا على تيارات ما بعد مشبكية مصغرة من عصبونات CA1 تم تحفيزها بواسطة حويصلات مفردة من الغلوتامات أو GABA. تظهر اللوحتان A وB آثاراً نموذجية لتيار ما بعد مشبكي مصغر. وفي وجود مادة Tetrodotoxin، تم قياس الـ EPSCs المصغرة عند -16 millivolts والـ IPSCs المصغرة عند 0 millivolts بالتتابع في نفس العصبونات.

تُظهر اللوحة C مخططات ثنائية الأبعاد لسعات mEPSC و mIPSC في الجرذان غير المدربة والمدربة وغير المقترنة والتي خضعت للمشي الإرشادي. وتُظهر اللوحة D المخططات الخاصة بالترددات المصغرة. وكما يتضح في اللوحات السفلية، أدت التدريبات السياقية إلى تعزيز المشابك الاستثارة والتثبيطية بشكل ملحوظ، مما عزز تنوع المدخلات المشبكية إلى العصبونات.

باختصار، تُعد تقنية تثبيت التيار (current-clamp) مفيدة لتحليل التغيرات في خصائص الخلية الناتجة عن التعلم. كما أن تقنية تثبيت الجهد (voltage-clamp) تمثل أداة قوية لتحليل اللدونة الناتجة عن التعلم في المشابك العصبية الاستثارة والمثبطة. ويمكن العثور على النتائج التفصيلية لهذه التحاليل في المنشورات التالية.