التحقيق في متشابك وسم / القبض على والصليب التقاط باستخدام الحاد شرائح الحصين من القوارض

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة اللدونة طويلة المدى وعملياتها الترابطية مثل وضع العلامات المشبكية والتقاطها ووضع العلامات المتقاطعة في الخلايا العصبية شبه المعدنية CA one باستخدام شرائح الحصين Q من القوارض. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح الدماغ أولا وعزل الحصين بسرعة إلى سائل نخاعي مخيخي صناعي بارد مؤكسج. الخطوة الثانية هي تحضير شرائح الحصين الحادة باستخدام قطاعة الأنسجة اليدوية واحتضانها في غرفة الواجهة.

بعد ذلك ، يتم وضع قطبين محفزين وقطبين للتسجيل في منطقة CA واحدة لتسجيل استجابات EPSP الميدانية والارتفاع السكاني من مدخلين متشابكين. تتمثل الخطوة الأخيرة في إحداث شكل عابر من اللدونة في مدخلات متشابكة مرة واحدة وشكل مستمر من اللدونة في مدخلات أخرى خلال نافذة زمنية محددة. في النهاية ، يتم تسجيل استجابات EPSP الميدانية من كلا المدخلين لفترات طويلة للتحقيق في التقاط العلامات المشبكية وآليات الالتقاط المتقاطع.

يوفر وضع العلامات المشبكي والالتقاط أساسا مفاهيميا لكيفية تحول الذاكرة قصيرة المدى إلى ذاكرة طويلة المدى خلال إطار زمني معين. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم الخطوات التجريبية لأنها تتضمن التحفيز والتسجيل من مدخلات متشابكة متعددة. سيظهر الإجراء ماهيش شيرا ، المنجل وطلاب الدراسات العليا من مختبري.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد السائل الدماغي النخاعي وقم بفقاعاته بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. املأ الجزء السفلي من حجرة الواجهة بالماء المقطر إلى حوالي 70٪ من سعتها. ثم قم بتشغيل الضبط المسبق لوحدة التحكم في درجة الحرارة على 32 درجة مئوية.

بعد ذلك ، اغسل الحجرة العلوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة عن طريق تشغيل الماء المقطر عبر أنبوب التدفق بمعدل تدفق مرتفع قبل التبديل إلى السائل الدماغي النخاعي بمعدل تدفق واحد مليلتر في الدقيقة. ثم ضع شبكة في الغرفة العلوية لتوفير سطح راحة للشرائح. ابدأ الكربوجين في الغرفة السفلية ، واغمر أنبوب التدفق في السائل الدماغي النخاعي الذي يتم كربوجين باستمرار.

اترك 20 دقيقة حتى يتم تشبع السائل الدماغي النخاعي بالكربوجين وملء الغرفة العلوية. في هذه الخطوة ، قم بتركيب شفرة حلاقة على مفرمة المناديل وتأكد من محاذاة حافة القطع بالتساوي. اختبرها عن طريق تقطيع ورق ترشيح صغير للتأكد من أن الشفرة مؤمنة بإحكام.

ثم اضبط ميكرومتر الورني المنزلق على موضع البداية. الآن احصل على رأس فأر تم القتل الرحيم وباستخدام مقص القزحية ، قم بعمل قطع في الجمجمة الخلفية لإزالة جذع الدماغ. ثم قم بعمل شق صغير على طول الجانب الأيمن من الجمجمة وشق أطول على اليسار.

قم بإزالة الجمجمة بعناية باستخدام UR عظمي بدءا من الجانب الأيسر والانتقال إلى الجانب الأيمن من الجمجمة. للكشف عن القشرة والطبقة الرقيقة من الجافية التي تغطيها ، قم بإزالة الجافية بعناية بملعقة رفيعة ثم قم بإزالة الصفائح الأمامية بالعظم. Ro.بعد ذلك ، قم بإزالة الجافية المتبقية على وجه التحديد في التقاطع بين القشرة والمخيخ مع الطرف المسطح للملعقة ، وتجنب إتلاف الدماغ عن طريق الحفاظ على الضغط لأعلى.

باستخدام الملعقة ، اغرف الدماغ برفق في طبق بتري على كتلة تبريد من الألومنيوم مملوءة بالسائل الدماغي النخاعي البارد والغازي لعزل الحصين باستخدام مشرط رقم 11 ، وقم بعمل قطع مستقيم لإزالة المخيخ وقطع آخر لإزالة ربع الجزء الأمامي من الدماغ. ثم قم بعمل قطع سهمي ضحل على طول خط الوسط. بدءا من خط الوسط.

قم بإزالة القشرة بعناية باستخدام قشارة المنجل للكشف عن الحصين الظهري. بعد ذلك ، قم بإزالة طبقة القشرة فوق الحصين. قم بعمل قطع صغير لمفوض الحصين.

قم بإزالة الحصين برفق باستخدام قشارة المنجل ، بدءا من الطرف الظهري باستخدام حركات التدحرج. بعد ذلك ، قم بإزالة أي قشرة وأنسجة ضامة حول الحصين المعزول باستخدام الطرف المنحني لقشارة المنجل. لتقطيع أنسجة الحصين ، ضع قطعة من ورق ترشيح واتمان المنقوع بالسائل الدماغي النخاعي مقاس 30 ملم على مرحلة التقطيع في آلة التقطيع اليدوية.

انقل أنسجة الحصين إلى ورق الترشيح. باستخدام الطرف المسطح للقلم المنجلي ، حرك ورق الترشيح لمحاذاة الحصين في الاتجاه المناسب بالنسبة لشفرة القطاعة ، بحيث يتم تقطيع الحصين بزاوية حوالي 70 درجة إلى fia. بعد ذلك ، امسح المحلول الزائد المحيط بأنسجة الحصين.

باستخدام ورق ترشيح مطوي ، قم بتقطيع الحصين إلى شرائح عرضية وتخلص من الأنسجة من الطرف الأقصى للحصين حيث يكون مورفولوجيا الشريحة غير واضحة. ثم قم بتقطيع الأنسجة المتبقية إلى شرائح بسمك 400 ميكرون عن طريق ضبط ميكرومتر الورنية بعد كل جولة من التقطيع. بعد كل قطع ، انقل الشريحة برفق من الشفرة باستخدام فرشاة ذات شعيرات ناعمة إلى دورق صغير مملوء بالكربونات الباردة A CSF.

ثم انقل الشرائح برفق إلى الشبكة في حجرة الشرائح باستخدام ماصة بلاستيكية نظيفة. باستخدام طرف عريض ، اضبط موضع الشرائح بعناية بطريقة تسهل موقع القطب وفحص التسجيل للتأكد من أن الشرائح محاطة بدرجة كافية بطبقة من السائل الدماغي النخاعي ، ولكنها ليست مغمورة بالكامل. بعد ذلك ، قم بتغطية الغرفة واحتضان الشرائح لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في تجارب وضع العلامات المشبكية والتقاط.

تحت المجهر ، ضع القطبان الكهربائيان المحفزان في ذرة الطبقة الشعاعية ل CA منطقة واحدة لتحفيز ألياف Schaffer الجانبية وعند تسجيل القطب الكهربائي في المنطقة التغصنية القمية في كاليفورنيا في منتصف الطريق بين الأقطاب الكهربائية المحفزة. لتسجيل استجابات F-E-P-S-P، ضع قطب تسجيل آخر في الطبقة الصغيرة. طبقة DO لتسجيل ارتفاع عدد السكان.

عندما تلمس جميع الأقطاب الكهربائية الشريحة ، قم بإجراء تحفيز اختبار لضمان إمكانية الحصول على إشارة EPSP مناسبة في كلا المدخلين. بمجرد الحصول على إشارة F-E-P-S-P المناسبة ، قم بخفض الأقطاب الكهربائية بعناية بحوالي 200 ميكرون باستخدام مقابض الحركة الدقيقة للمعالجات. ثم اترك 20 دقيقة حتى تتعافى الشريحة.

بعد ذلك ، حدد علاقة خرج الإدخال عن طريق قياس ميل EPSP المجال على نطاق من شدة التيار من 20 ميكروأمبير إلى 100 ميكروأمبير. ثم لكل إدخال ، اضبط شدة التحفيز التي تستحضر 40٪ من الحد الأقصى لميل EPSP للمجال كمحفزات ثابتة طوال التجربة. بعد 15 إلى 20 دقيقة ، ابدأ في تسجيل سجل خط الأساس خط أساس ثابت لا يقل عن 30 إلى 60 دقيقة قبل تحريض L-T-P-L-T-D في مدخل واحد ، وحث LTP مبكرا باستخدام بروتوكول تيتين ضعيف يتكون من تحفيز واحد عالي التردد.

بينما يستمر المدخلات الأخرى في تسجيل خط الأساس بعد 30 دقيقة من تحريض LTP المبكر ، قم بتحفيز LTP متأخر في المدخلات S two ، باستخدام بروتوكول تيتين قوي يتضمن تحفيزا متكررا عالي التردد مع فاصل زمني يبلغ 10 دقائق. ثم قم بتسجيل استجابات EPSP الميدانية لفترات ممتدة للكشف عن تحويل LTP المبكر في الإدخال S واحد إلى LTP المتأخر عن طريق وضع العلامات والالتقاط المشبكي. وبالمثل ، في تجربة الالتقاط المتقاطع ، قم أولا بتحفيز LTP مبكر وتبع مدخل واحد بعد 30 دقيقة تحريض LTD متأخر في مدخل آخر ، باستخدام بروتوكول تحفيز قوي منخفض التردد يتكون من 900 رشقة نارية على مدى 15 دقيقة.

ثم قم بتسجيل استجابات EPSP الميدانية لفترات طويلة للكشف عن تحويل LTP المبكر في المدخلات S واحد إلى LTP المتأخر بواسطة الالتقاط المتقاطع. في هذا التمثيل ، يتم وضع قطبين محفزين في ذرة شعاع الطبقة من منطقة CA واحدة لتحفيز مدخلين متشابكين مستقلين ولكنهما متداخلان. على CA خلية عصبية شبه معدنية واحدة اثنين من قطبي التسجيل خارج الخلية.

واحد لتسجيل F-E-P-S-P من المقصورة التغصنية القمية. وآخر لتسجيل ارتفاع السكان الجسدي من أجسام الخلايا شبه المعدنية تقع في ذرة الطبقة الشعاعية والطبقة الفقرة على التوالي. يوضح هذا الشكل الأسبوع الذي سبق النموذج القوي لدراسة وضع العلامات المشبكية والتقاطها.

يتم تطبيق التيتين الضعيف على S واحد لتحفيز LTP المبكر ، متبوعا بتيتين قوي من S اثنين في 30 دقيقة للحث على LTP المتأخر ، ويوضح هذا الشكل الأسبوع السابق للنموذج القوي لدراسة وضع العلامات المتقاطعة. يتم تحفيز LTP المبكر عن طريق التتين الضعيف في S واحد ، يليه تحريض LTD المتأخر في S الثاني باستخدام بروتوكول تحفيز قوي منخفض التردد. بعد 30 دقيقة في S واحد ، يتم تحويل LTP المبكر إلى LTP المتأخر الذي يستمر ست ساعات ، مما يدل على وضع العلامات المتقاطعة والالتقاط.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية التشريح وتحضير الشرائح هذه بسرعة كبيرة في غضون ثلاث إلى خمس دقائق. وبالتالي ، يمكن الحفاظ على صلاحية الشرائح للتسجيلات طويلة المدى. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمرء أيضا اختبار تأثيرات العوامل الدوائية المختلفة على عمليات وضع العلامات والالتقاط المشبكي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب اللدونة الوظيفية طويلة المدى وعمليات وضع العلامات والتقاطها المشبكي.