التحقيق في متشابك وسم / القبض على والصليب التقاط باستخدام الحاد شرائح الحصين من القوارض

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة اللدونة طويلة المدى وعملياتها الترابطية مثل الوسم التشابكي، والالتقاط، والوسم المتقاطع في عصبونات المنطقة CA1 في الحصين باستخدام شرائح من حصين القوارض. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الدماغ وعزل الحصين بسرعة في سائل دماغي شوكي اصطناعي بارد ومؤكسج. وتتمثل الخطوة الثانية في تحضير شرائح حصين حادة باستخدام قطاعة أنسجة يدوية وتحضينها في غرفة واجهة.

يتم وضع قطبين محفزين وقطبين للتسجيل التاليين في منطقة CA1 لتسجيل استجابات جهد ما بعد التشابك الاستثاري (fEPSP) وجهد القمة الجماعية (population spike) من مدخلين تشابكيين. وتتمثل الخطوة النهائية في تحفيز شكل عابر من اللدونة في أحد المدخلات التشابكية وشكل مستمر من اللدونة في المدخل الآخر ضمن نافذة زمنية محددة. وفي النهاية، يتم تسجيل استجابات fEPSP من كلا المدخلين لفترات ممتدة لاستقصاء آليات التقاط ووسم التشابك العصبي (synaptic tagging capture) والالتقاط المتقاطع (cross capture).

يوفر الوسم والالتقاط التشابكي أساساً مفاهيمياً لكيفية تحول الذاكرة قصيرة المدى إلى ذاكرة طويلة المدى ضمن إطار زمني محدد. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم الخطوات التجريبية لأنها تتضمن التحفيز والتسجيل من مدخلات تشابكية متعددة. سيقوم بتقديم هذا الإجراء طلاب الدراسات العليا Mahesh Shira و machete و maima Sharma من مختبري.

لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير A CSF وتمرير فقاعات من 95% oxygen و 5% carbon dioxide فيه. املأ الجزء السفلي من غرفة الواجهة بالماء المقطر حتى يصل إلى حوالي 70% من سعتها. بعد ذلك، قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة المضبوطة مسبقاً على 32 °C.

بعد ذلك، اغسل الحجرة العلوية لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة عن طريق تمرير الماء المقطر عبر أنبوب التدفق بمعدل تدفق مرتفع، قبل الانتقال إلى استخدام A CSF بمعدل تدفق قدره 1 milliliter per minute. ثم ضع شبكة في الحجرة العلوية لتوفير سطح استراحة للشرائح. ابدأ عملية carbogen في الحجرة السفلية مع غمر أنبوب التدفق في A CSF الذي يخضع لعملية carbogen مستمرة.

اترك A CSF لمدة 20 دقيقة ليتم تشبعه بالـ carbogen وليملأ الغرفة العلوية. في هذه الخطوة، قم بتركيب شفرة حلاقة على قطاعة الأنسجة وتأكد من محاذاة حافة القطع بشكل متساوٍ. اختبر ذلك عن طريق تقطيع قطعة صغيرة من ورق الترشيح للتأكد من تثبيت الشفرة بإحكام.

بعد ذلك، قم بضبط الميكرومتر الورنية المنزلق إلى وضع البداية. الآن، أحضر رأس جرذ تم التخلص من حياته رحمةً، وباستخدام مقص القزحية، قم بإجراء قطع عبر الجزء الخلفي من الجمجمة لإزالة جذع الدماغ. ثم قم بعمل شق صغير على طول الجانب الأيمن من الجمجمة وشق أطول على الجانب الأيسر.

أزل الجمجمة بعناية باستخدام أداة قص العظام، بدءاً من الجانب الأيسر وصولاً إلى الجانب الأيمن من الجمجمة. ولكشف القشرة المخية والطبقة الرقيقة من الأم الجافية التي تغطيها، أزل الأم الجافية بعناية باستخدام ملعقة مسطحة رقيقة، ثم أزل الصفائح الجبهية باستخدام أداة قص العظام. بعد ذلك، أزل ما تبقى من الأم الجافية، وتحديداً في منطقة الاتصال بين القشرة المخية والمخيخ، باستخدام الطرف المسطح للملعقة، وتجنب إتلاف الدماغ من خلال الحفاظ على الضغط باتجاه الأعلى.

باستخدام الملعقة المسطحة (spatula)، انقل الدماغ برفق إلى طبق بتري موضوع فوق كتلة تبريد من الألومنيوم ممتلئة بـ A CSF بارد ومكربن؛ لعزل الحصين، استخدم مشرطاً رقم 11 وقم بإجراء قطع مستقيم لإزالة المخيخ، وقطع آخر لإزالة ربع الجزء الأمامي من الدماغ. ثم قم بإجراء قطع سهمي ضحل على طول الخط المتوسط، بدءاً من الخط المتوسط.

قم بإزالة القشرة بعناية باستخدام المِكشط المنجلي للكشف عن الحصين الظهري. بعد ذلك، قم بإزالة طبقة القشرة الموجودة فوق الحصين. اصنع قطعاً صغيراً في الموصل الحصيني.

أزِل الحصين برفق باستخدام المِكشطة المنجلية، بدءاً من الطرف الظهري وباستخدام حركات دائرية. بعد ذلك، أزِل أي جزء من القشرة والأنسجة الضامة المحيطة بالحصين المعزول باستخدام الطرف المنحني للمِكشطة المنجلية. لتقطيع نسيج الحصين، ضع قطعة من ورق ترشيح واتمان (Watman) مقاس 30 مليمتر مبللة بسائل CSF على منصة التقطيع الخاصة بالقاطعة اليدوية.

انقل نسيج الحصين إلى ورقة الترشيح. وباستخدام الطرف المسطح من مشرط المنجل، حرك ورقة الترشيح لمحاذاة الحصين في اتجاه مناسب بالنسبة لشفرة القاطعة، بحيث يتم تقطيع الحصين بزاوية تبلغ حوالي 70 درجة بالنسبة لـ fia. بعد ذلك، قم بتجفيف المحلول الزائد المحيط بنسيج الحصين.

باستخدام ورقة ترشيح مطوية، قم بتقطيع الحصين تقطيعاً مستعرضاً، وتخلص من الأنسجة الموجودة في الطرف الأقصى من الحصين حيث لا تكون مورفولوجيا الشريحة واضحة. بعد ذلك، قم بتقطيع الأنسجة المتبقية إلى شرائح بسمك 400 micron عن طريق ضبط الميكرومتر الورنية بعد كل جولة تقطيع. بعد كل قطع، انقل الشريحة برفق من الشفرة باستخدام فرشاة ذات شعيرات ناعمة إلى دورق صغير مملوء بـ cold carbonated A CSF.

بعد ذلك، انقل الشرائح برفق إلى الشبكة الموجودة في غرفة الشرائح باستخدام ماصة بلاستيكية نظيفة. وباستخدام طرف عريض، اضبط وضعية الشرائح بعناية بطريقة تسهل تحديد موقع القطب الكهربائي والتحقق من التسجيل للتأكد من أن الشرائح محاطة بشكل كافٍ بطبقة من A CSF، ولكن دون أن تكون مغمورة بالكامل. بعد ذلك، قم بتغطية الغرفة وحضن الشرائح لمدة تتراوح بين ساعتين وثلاث ساعات في تجارب وسم والتقاط التشابكات العصبية.

قم بتحديد موضع القطبين المحفزين تحت المجهر في الطبقة الشعاعية (stratum radiatum) لمنطقة CA1 لتحفيز ألياف شافر الجانبية (Schaffer collateral fibers)، وضع قطب التسجيل في المنطقة الشجيرية القمية لـ CA1 في منتصف المسافة بين القطبين المحفزين. لتسجيل استجابات F-E-P-S-P، ضع قطب تسجيل آخر في الطبقة الهرمية (stratum pyramidale) لتسجيل ذروة الجماعة (population spike).

عندما تلامس جميع الأقطاب الكهربائية الشريحة، قم بإرسال تحفيز اختباري للتأكد من إمكانية الحصول على إشارة جهد ما بعد التشابك الميداني (fEPSP) مناسبة في كلا المدخلين. وبمجرد الحصول على إشارة fEPSP مناسبة، اخفض الأقطاب الكهربائية بعناية لمسافة 200 ميكرون إضافية باستخدام مقابض الحركة الدقيقة للمناورات. ثم اترك الشريحة لمدة 20 دقيقة للتعافي.

بعد ذلك، يتم تحديد علاقة المدخلات والمخرجات عن طريق قياس ميل جهد ما بعد التشابك الميداني (field EPSP) عبر نطاق من شدة التيارات يتراوح من 20 microamps إلى 100 microamps. ثم لكل مدخل، يتم تعيين شدة التحفيز التي تثير 40% من أقصى ميل لـ field EPSP كمنبهات ثابتة طوال التجربة. بعد 15 إلى 20 دقيقة، ابدأ بتسجيل الخط القاعدي، وسجل خطاً قاعدياً مستقراً لمدة لا تقل عن 30 إلى 60 دقيقة قبل تحفيز L-T-P-L-T-D في مدخل واحد، وقم بتحفيز LTP مبكر باستخدام بروتوكول tetin ضعيف يتكون من تحفيز واحد عالي التردد.

بينما يستمر المدخل الآخر في تسجيل خط الأساس بعد 30 دقيقة من تحفيز LTP المبكر، قم بتحفيز LTP المتأخر في المدخل S الثاني، باستخدام بروتوكول tetin قوي يتضمن تحفيزاً متكرراً عالي التردد بفاصل زمني بين المجموعات يبلغ 10 دقائق. ثم سجل استجابات field EPSP لفترات ممتدة للكشف عن تحول LTP المبكر في المدخل S الأول إلى LTP متأخر عن طريق عملية وسم والتقاط التشابك العصبي. وبالمثل، في تجربة الالتقاط المتقاطع، قم أولاً بتحفيز LTP مبكر في أحد المداخل، يليه بعد 30 دقيقة تحفيز LTD متأخر في مدخل آخر، باستخدام بروتوكول تحفيز قوي منخفض التردد يتكون من 900 دفعة على مدار 15 دقيقة.

ثم قم بتسجيل استجابات EPSP الميدانية لفترات زمنية ممتدة للكشف عن تحول LTP المبكر في المدخل S one إلى LTP متأخر من خلال الالتقاط المتقاطع. في هذا التمثيل، يتم وضع قطبين محفزين في stratum radi atom لمنطقة CA one لتحفيز مدخلين مشبكيين مستقلين ولكن متداخلين. ويتم وضع قطبين للتسجيل خارج الخلية على الخلايا العصبية الهرمية في CA one.

واحد لتسجيل F-E-P-S-P من القسم الشجيري القمي. وآخر لتسجيل ذروة السكان الجسدية من أجسام الخلايا الجانبية الموجودة في stratum radiatom وstratum pyramidale على التوالي. يوضح هذا الشكل نموذج "الأسبوع قبل القوي" لدراسة وسم واقتناص التشابكات العصبية.

يتم تطبيق تحفيز ضعيف على S one لتحفيز LTP المبكر، يليه تحفيز قوي لـ S two بعد 30 دقيقة لتحفيز LTP المتأخر، ويوضح هذا الشكل النموذج الضعيف قبل النموذج القوي لدراسة الوسم المتبادل (cross tagging). يتم تحفيز LTP المبكر بواسطة تحفيز ضعيف في S one، يليه تحفيز LTD المتأخر في S two باستخدام بروتوكول تحفيز قوي منخفض التردد. بعد 30 دقيقة في S one، يتحول LTP المبكر إلى LTP متأخر يستمر لمدة ست ساعات، مما يظهر عملية الوسم المتبادل والاستحواذ (capture).

بمجرد إتقان هذه التقنية في التشريح وتحضير الشرائح، يمكن تنفيذها بسرعة كبيرة خلال ثلاث إلى خمس دقائق. وبذلك، يمكن الحفاظ على حيوية الشرائح لإجراء تسجيلات طويلة المدى. وباستخدام هذه الطريقة، يمكن أيضاً اختبار تأثيرات العوامل الفارماكولوجية المختلفة على عمليات وسم والتقاط المشابك العصبية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء تجارب اللدونة الوظيفية طويلة المدى وعمليات الوسم والالتقاط التشابكي.