فحص الجزيئات النانوية النشطة بيولوجيا في الخلايا المناعية البلعمة لمثبطات مستقبلات تشبه تول

الهدف العام من إجراء الفحص هذا هو تحديد الجسيمات النانوية النشطة بيولوجيا الجديدة التي يمكن أن تمنع إشارات المستقبلات الشبيهة بالحصيلة يمكن أن تساعدك هذه الطريقة في تحديد مثبطات النانو الجديدة التي تستهدف إشارات المستقبلات الشبيهة بالحصيلة في الخلايا المناعية الفطرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وقوية وسهلة الأداء باستخدام أنظمة خلية المراسل.

تمتد تطبيقات هذه التقنية إلى علاج العديد من الأمراض الالتهابية لأنه وجد أن إشارات المستقبلات الشبيهة بالحصيلة متورطة في التسبب في هذه الأمراض. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر فحصا عاليا للجسيمات النانوية والذهب ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة الجسيمات النانوية الأخرى بالإضافة إلى الجزيئات الصغيرة العلاجية والبيولوجيا. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد وسائط الثقافة كما هو موضح في بروتوكول النص.

بعد ذلك ، أضف 100 مل من الماء الخالي من السموم الداخلية فائقة النقاء إلى قارورة زجاجية نظيفة سعة 125 مل. أضف كيسا واحدا من مسحوق ركيزة الفوسفاتيز القلوي الجنيني المفرز ، وقم بتدوير المحلول برفق حتى يذوب تماما. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لضمان الذوبان الكامل للركائز.

باستخدام غشاء 0.2 ميكرومتر ، قم بتصفية المحلول. يحفظ على حرارة أربع درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام. بعد ذلك ، أضف كيسا واحدا من مسحوق ركيزة لوسيفيراز إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر يحتوي على 25 مل من الماء الخالي من السموم الداخلية فائق النقاء.

بعد ذوبان المسحوق تماما ، قم بتخزينه على درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع حتى يصبح جاهزا للاستخدام. بعد ذلك ، قم بإعداد حلول المخزون لجميع الكواشف الأخرى كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد زراعة الخلايا وتحضيرها ، انقلها من قارورة الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي.

قم بتدوير الخلايا بمعدل 300 مرة جم لمدة خمس دقائق. ثم أعد تعليقها في وسط R-10 بتركيز 1 × 10 إلى 6 خلايا لكل مليلتر. أضف حصصا من محلول PMA إلى تعليق الخلية بحيث يكون التركيز النهائي 50 نانوغرام لكل ملليلتر.

صب تعليق الخلية في خزان كاشف معقم. باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة استزراع ذات قاع مسطح سعة 96 بئرا. احتضان في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، استخدم شفاط فراغ لإزالة وسط الثقافة بعناية. باستخدام مجهر مقلوب ، تحقق من الخلايا للتأكد من أن البلاعم المشتقة ملتصقة في قاع البئر. اغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام 100 ميكرولتر من PBS لكل بئر لكل غسلة.

ثم أضف 100 ميكرولتر من وسط R-10 الطازج إلى كل بئر. دع الخلايا ترتاح لمدة يومين في حاضنة عند 37 درجة مئوية قبل إجراء فحص المراسل. أولا ، حدد جرعة LPS المثلى كما هو موضح في بروتوكول النص.

بعد ذلك ، أضف 180 ميكرولترا من محلول Quanti-Blue الدافئ مسبقا إلى كل بئر من لوحة سفلية مسطحة جديدة مكونة من 96 بئرا. ثم انقل 20 ميكرولترا من المادة الطافية من كل عينة إلى اللوحة. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين للسماح للون بالتطور من اللون الوردي إلى الأزرق الداكن.

بعد أن تكون الكثافة الضوئية أعلى من واحد ، استخدم قارئ اللوحة لتحديد الامتصاص عند 655 نانومتر. لبدء تحليل تنشيط IRF ، انقل 10 ميكرولترات من المادة الطافية الطازجة من كل عينة إلى صفيحة بيضاء مسطحة القاع الشفافة 96 بئر. باستخدام الحقن التلقائي ، أضف 50 ميكرولترا من محلول لوسيفيراز إلى كل بئر.

ثم اجمع التلألؤ على الفور جيدا لإنتاج منحنى استجابة الجرعة لتحديد تركيز LPS الأمثل لفحص الجسيمات النانوية. بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي 20 حجما من المحلول الهجين الببتيد-GMP في أنابيب Eppendorf سعة 1.5 ملليلتر عند 18 ، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة. تخلص بعناية من المواد الطافية.

انقل الهجينة إلى أنبوب واحد جديد واغسلها مرتين باستخدام مليلتر واحد من PBS. بعد ذلك ، قم بتعليق الهجينة المغسولة في حجم واحد من وسط R-10. امزج كميات متساوية من الهجينة المركزة و LPS المحتوي على وسط R-10 بحيث يكون التركيز النهائي للهجينة و LPS 100 نانومولار و 10 نانوغرام لكل مليلتر ، على التوالي.

بعد ذلك ، قم بإزالة وسط الثقافة من لوحة زراعة البلاعم. أضف 100 ميكرولتر من خليط LPS الهجين إلى كل بئر ، مع ثلاث تكرارات لكل حالة. قم بتضمين عنصر تحكم سلبي وعنصر تحكم LPS.

احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم انقل وسط كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي منفصل. الطرد المركزي الأنابيب عند 18،000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.

انقل المواد الطافية إلى طبق سفلي دائري جديد مكون من 96 بئر. لبدء فحص المراسل على هذه العينات ، أضف 180 ميكرولترا من محلول Quanti-Blue الدافئ مسبقا إلى كل بئر من صفيحة قاع مسطحة جديدة مكونة من 96 بئرا. ثم انقل 20 ميكرولترا من المواد الطافية من كل عينة إلى هذه اللوحة.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين حتى يتطور اللون الأزرق الداكن إلى كثافة بصرية تزيد عن واحدة. بعد ذلك ، استخدم قارئ الألواح لتسجيل الامتصاص عند 655 نانومتر. بعد ذلك ، انقل 10 ميكرولترات من المادة الطافية الطازجة من كل عينة إلى صفيحة بيضاء ذات قاع مسطح شفاف 96 بئرا.

باستخدام حاقن أوتوماتيكي ، أضف 50 ميكرولترا من محلول لوسيفيراز إلى كل بئر ، وسجل التلألؤ جيدا على الفور. بعد ذلك ، تحقق من التأثير المثبط للمرشحين المحتملين ، وقم بتقييم خصوصية TLR كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة ، تم الكشف عن تنشيط NF-Kappa B AP1 بواسطة مقايسة SEAP اللونية ، حيث يؤدي تنشيط TLR-4 بواسطة LPS إلى تنشيط NF-Kappa B AP1 وإنتاج SEAP.

SEAP الذي تم إصداره بتحويل الركيزة ، مما يؤدي إلى تغيير اللون يتناسب مع كمية SEAP المنبعثة عند التحفيز. يتم قياس ذلك عن طريق قياس الامتصاص عند 655 نانومتر. بعد ذلك ، أدى تنشيط IRF بوساطة LPS إلى التعبير عن لوسيفيراز ، مما حفز الركيزة لإنتاج اللمعان.

يتم تحديد تركيز LPS الأمثل البالغ 10 نانوغرام لكل مليلتر من استجابات الجرعة هذه لفحص مكتبة تم إنشاؤها مسبقا من الببتيد-GMP الهجينة. من هذا ، يتم تحديد مجموعة من الهجينة لقدرتها القوية على تثبيط التنشيط الناجم عن LPS لكل من NF-Kappa B AP1 و IRF. يظهر التحقق من صحة هذا النشاط المثبط أنه مع زيادة تركيز LPS ، تقل التأثيرات المثبطة للهجين ، كما هو متوقع.

ثم يتم إجراء النشاف المناعي لتأكيد نشاط التثبيط. ينظر إلى هجين الرصاص على أنه يقلل من فسفرة p65 ، ويمنع تدهور I-Kappa B alpha ، ويؤخر فسفرة IRF3 ، مما يؤكد أن هجين الرصاص ، P12 ، قادر على تثبيط إشارات TLR-4 بوساطة LPS. يكشف التحقيق الإضافي أن P12 يقلل أيضا من إشارات NF-Kappa B AP1 بوساطة TLR-2 و TLR-5 ، بالإضافة إلى تنشيط IRF بوساطة TLR-3 ، مما يشير إلى أن P12 له نشاط مثبط قوي على مسارات TLR متعددة.

بعد هذا الإجراء ، يجب إجراء تدابير أخرى مثل النشاف المناعي ومقايسة السمية الخلوية من أجل التحقق من صحة نتائج الفحص وتجنب الاكتشاف الإيجابي الكاذب. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لباحثين آخرين في مجال الطب النانوي لاستكشاف مثبطات النانو في إشارات المستقبلات الشبيهة بالحصيلة كعلاجات من الجيل التالي وإعلامي.