تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

تحليل الآليات الخلوية لاستيعاب الجسيمات النانوية والبكتيريا عن طريق قياس التدفق الخلوي للتصوير متعدد الأطياف. تتم معالجة البلاعم أولا باستخدام cyto klain D لتثبيط بلمرة الأكتين. تضاف الجسيمات النانوية أو السالمونيلا إلى البلاعم ، أحادية الطبقة وتحتضن.

ثم يتم حصاد البلاعم وإصلاحها وتصنيفها للتحليل باستخدام دفق الصور. تتميز خلايا مقياس التدفق الخلوي للتصوير متعدد الأطياف التي تحتوي على جسيمات نانوية داخلية و / أو سالمونيلا عن تلك التي تحتوي على جزيئات نانوية مرتبطة بالسطح و / أو السالمونيلا. تشير البيانات الناتجة إلى أن كلا من السالمونيلا والجسيمات النانوية يتم استيعابها فقط بواسطة الخلايا التي لم يتم معالجتها ب cyto klain.

D مما يشير إلى أن الاستيعاب يعتمد على الأكتين. تتمتع هذه التقنية بالعديد من المزايا مقارنة بالطرق الحالية مثل قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر. في المقام الأول ، يوفر مقياسا دقيقا لشدة إشارة الفلورسنت والدقة المكانية بين الميزات الخلوية المختلفة بسرعة عالية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية لكل من لقاح المواد الحيوية وأبحاث توصيل الأدوية ، بالإضافة إلى مجموعة من دراسات تفاعل مسببات الأمراض. يتضمن ذلك تحديد مسارات الاستيعاب التي تستخدمها الجسيمات النانوية متعددة أنهيدريد والبكتيريا. بشكل عام ، غالبا ما يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة.

من المهم قضاء بعض الوقت في معايرة الأصباغ من أجل الحصول على إشارات مضان مثالية. أيضا ، يستغرق التعرف على البرنامج وإنشاء قوالب التحليل وقتا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما وجدنا أن الجسيمات النانوية المائية المتعددة تظهر خصائص تحاكي مسببات الأمراض أثناء استخدام الفحص المجهري وتقنيات أخرى.

أردنا بعد ذلك نظاما عالي الإنتاجية لمقارنة عمليات الاستيعاب التي تستخدمها السالمونيلا وجسيمات هيدريد حبوب اللقاح النانوية قبل إجراء الفحص. يجب حصاد جميع مزارع خلايا الثدييات والبكتيرية وإعداد معلقات الجسيمات النانوية. ابدأ بحصاد خلايا RA W2 64.7 المتقاربة باستخدام مكشطة الخلايا.

حدد رقم الخلية باستخدام مقياس الخلوي الدموي. ثم ضع الخلايا في طبق مزرعة 24 بئرا بكثافة خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في 0.5 ملليلتر. احتضان DMEM الكامل بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية وحاضنة CO2 بنسبة 5٪.

لتحضير السالمونيلا tarica ، قم بتحويل السالمونيلا المخففة في C-D-M-E-M للحصول على تعدد من العدوى يبلغ مائة لكل RA W2 64.7 خلية في أنبوب ثقافة زجاجي بغطاء لولبي للأوتوكلاف 16 × 125 ملم. بعد ذلك ، باستخدام ورق مصل اللبن المعقم ، قم بوزن خمسة ملليغرامات من الجسيمات النانوية البولي أنهيدريد المحملة بنسبة 1٪ من FITC والتي تم إنشاؤها كما هو موضح من قبل زملاء ريان في منشورهم لعام 2009 وأبحاثهم الصيدلانية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. أضف الجسيمات النانوية إلى 0.5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد ، وضعه على الثلج.

إبقاء الأنبوب على الجليد. استخدم معالج سائل بالموجات فوق الصوتية مع طرف صغير لصوتنة التعليق لمدة 25 ثانية تقريبا بمعدل أربعة إلى ستة جول. الآن بعد أن أصبحت جميع الخلايا والكواشف المطلوبة جاهزة ، يمكن إجراء فحص البلعمة.

التسمية 24 ، ألواح زراعة أنسجة البئر التي تحتوي على خلايا RA W2 64.7 المستنبتة استعدادا للفحص على اللوحة الأولى. سيتم فحص كل من العينات التالية في ثلاث نسخ ، cyto و D مع الجسيمات النانوية ، cyto و D مع السالمونيلا ، المتوسطة مع الجسيمات النانوية ، المتوسطة مع الجسيمات النانوية فقط ، السالمونيلا فقط ، و AF ست خلايا صبغة 60 درجة مئوية فقط سيتم فحصها على اللوحة الثانية وستشمل الجسيمات النانوية المتوسطة بالإضافة إلى الحضانة المتوسطة بالإضافة إلى السالمونيلا عند درجة الحرارة المنخفضة هذه ، العمليات الخلوية البطيئة مثل البلعمة قبل ساعة واحدة من التحريض. أضف خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من cyto و D و C-D-M-E-M إلى الآبار المناسبة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، قم بتدوير تعليق الجسيمات النانوية وإضافة 10 ميكرولتر إلى الآبار المناسبة. ثم قم بدوامة السالمونيلا وأضفها إلى الآبار المناسبة بمعدل 100. اضغط على الطبق عدة مرات للخلط.

ثم ضع لوحات العينة عند 37 درجة مئوية ولوحات التحكم السالبة عند أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد الحضانة ، ضع الأطباق على الثلج ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS المثلج بدون الكالسيوم والمغنيسيوم عن طريق شفط الوسط القديم والتخلص منه لإزالة الجزيئات غير المرتبطة والسالمونيلا والخلايا الميتة أو المنفصلة. استخدام بتلة المغنيسيوم.

يعد Pre PBS في هذه المرحلة ضروريا لأنه يسهل انفصال الخلية عن الركيزة لحصاد الخلايا ، أضف 250 ميكرولترا من PBS المثلج البارد وكشط الآبار برفق ، وقم بتقطيع الخلايا المحصودة إلى أنابيب طرد مركزي صغيرة ذات غطاء مفاجئ من السيليكون ، واحتفظ بها على الجليد. اغسل الخلايا بإضافة مليلتر واحد من محلول الغسيل البارد ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 250 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي عن طريق النقر على أنبوب الطرد المركزي الصغير المقلوب على الورق.

منشفة إعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق جرف أنبوب الطرد المركزي الصغير برفق عبر رف أنبوب الاختبار. لإصلاح الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من 4٪ بارا فورمالديهايد في PBS واترك الخلايا تقف لمدة 15 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الخلايا بإضافة مليلتر واحد من محلول غسيل بيرم ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 250 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي كما كان من قبل. ثم تلطيخ خلايا RA W2 64.7. بالنسبة للأكتين ، أضف 100 ميكرولتر من محلول غسيل بيرم الذي يحتوي على Alexa Fluora foid في ستة 60 لمدة 15 دقيقة.

في درجة حرارة الغرفة ، يجب احتضان العينات غير الملوثة بالتجعيد ، وغسل العازلة بدون فين. بعد تلطيخ الخلايا ، اغسل الخلايا وطردها مرة أخرى ، ثم أعد تعليقها في 50 ميكرولترا من PBS تحتوي على 1٪ PFA وقم بتخزينها في الظلام عند أربع درجات مئوية حتى الحصول عليها. قم بالطاقة ودفق الصور وتشغيلها.

قم بإلهام وتهيئة السوائل في قائمة الملفات. اختر تحميل القالب الافتراضي. في معرض الصور ، عرض القائمة ، حدد الكل واضغط على إعداد التشغيل لبدء تصوير الخرزات إذا لزم الأمر ، اضبط التتبع الأساسي لتوسيط الصور بشكل جانبي.

حدد قناة الحقل الساطع وانقر فوق تعيين الكثافة. انتظر حتى يكون معامل سرعة التدفق للتباين أقل باستمرار من 0.2٪ في علامة التبويب المساعدة ، انقر فوق بدء الكل لتشغيل المعايرة والاختبارات والتحقق من اجتياز الجميع في البرنامج. انقر فوق تحميل العينة.

ثم عندما يطلب منك القيام بذلك ، ضع القارورة التي تحتوي على ألمع عينة. مع وجود جميع الفلوروكرومات في محمل العينة، حدد 40 × تكبير. بمجرد إنشاء إعدادات الأداة ، لا تقم بتغييرها للتجربة بأكملها.

قم بتشغيل كل ليزر في التجربة بالنقر فوق أيقونات الليزر في البرنامج واضبط طاقة الليزر بحيث يكون لكل فلوروكروم قيم بكسل قصوى بين 104 ، 000 عدد كما تم قياسه في المخططات المبعثرة. للتخلص من مجموعة الكائنات غير المرغوب فيها ، انقر فوق نافذة مصنف الخلية في البرنامج. ثم لجمع بيانات الخلية فقط ، حدد قناة الحد الأدنى للمنطقة الأولى للمجال الساطع ، واضبط القيمة على 50 ميكرومتر سيتم اعتبار الكائنات ذات المساحة أقل من 50 ميكرومتر حطاما ولن يتم الحصول عليها.

حدد القنوات المراد جمعها بالنقر فوق أيقونات القنوات المناسبة في البرنامج هنا. يتم تحديد القنوات 1 و2 و3 و4 و5 والسادسة ضمن علامة تبويب الإعداد. أدخل رقم الملف ومجلد الوجهة.

اضبط رقم التسلسل على واحد وعدد الأحداث المراد الحصول عليها على 5,000. انقر فوق تشغيل ، احصل لجمع وحفظ ملف بيانات التجربة الأول. انقر فوق FLL وقم بتشغيل العينة التجريبية التالية.

كرر حتى يتم جمع جميع العينات التجريبية. بعد ذلك ، لتشغيل عناصر التحكم ، انقر فوق إعدادات الشركة. سيؤدي ذلك إلى إيقاف تشغيل المجال الساطع والليزر المشتت وتمكين جمع جميع قنوات التألق ضمن علامة التبويب اكتساب.

قم بتغيير قيمة الإدخال إلى 500. ثم ضع أنبوب التحكم وانقر فوق تشغيل. احصل على جمع 500 خلية موجبة في عناصر تحكم ملطخة واحدة.

كرر لكل فلوروكروم في التجربة لتطوير مصفوفة تعويض. بمجرد الحصول على جميع عينات الصور ، قم بتشغيل برنامج تحليل الأفكار على كمبيوتر تحليل منفصل عن طريق النقر المزدوج على أيقونة الأفكار على سطح المكتب. انقر نقرا مزدوجا فوق معالج الاستيعاب وقم بتحميل أحد ملفات RIF النموذجية للاختبار.

ستوفر النافذة المنبثقة إرشادات لتحميل ملفات الاختبار. اتبع التعليمات وانقر على الزر التالي. بعد ذلك ، انقر فوق مصفوفة جديدة.

سيؤدي هذا إلى تشغيل معالج التعويض. عند المطالبة، حدد ملفات البيانات لعناصر التحكم في اللون الفردي لإضافتها. انقر فوق التالي من خلال المعالج التالي للإرشادات حتى يتم حفظ ملف مصفوفة التعويض وتحميله في المربع في الخطوة الثانية من معالج الاستيعاب.

انقر فوق التالي واتبع الإرشادات حتى يتم إنشاء ملف DAF. قم بتعيين خصائص عرض الصور عن طريق تحديد قنوات الصور المستخدمة أثناء الاكتساب. انقر فوق القناة الثانية ل FITC والقناة الخامسة ل AF ستة 60.

يتم تحديد Brightfield والمبعثر الجانبي افتراضيا. حدد قناة Brightfield O واحدة لإنشاء حدود الخلية والقناة O2 التي تم فيها جمع الجسيمات النانوية أو البكتيريا للمسبار الداخلي لتحديد مجموعة الخلايا المفردة ، يتم إنشاء مخطط مبعثر لمنطقة المجال الساطع مقابل نسبة العرض إلى الارتفاع للحقل الساطع لجميع الخلايا. يتطلب تحليل الإنتاجية العالية لملفات البيانات المتعددة ملف قالب ، وبالتالي من الأهمية بمكان تحديد البوابات بعناية أثناء إنشاء ملف قالب.

تمثل كل نقطة قيم صورة خلية فردية. انقر فوق أغنية واحدة. في رسم بياني لتحديد صورة تلك الخلية المعينة في معرض الصور.

بعد ذلك ، ارسم بوابة حول الخلايا بمساحة ونسبة العرض إلى الارتفاع التي تتوافق مع أحداث الخلية الواحدة. تحتوي الخلايا المفردة على نسبة عرض إلى ارتفاع تبلغ الجولة الأولى والمزدوجة. لديك نسبة عرض إلى ارتفاع تبلغ حوالي 0.5.

انقر فوق خلايا متعددة للتمييز بين المنطقة التي تحتوي على خلايا مفردة مقابل الخلايا المزدوجة أو الحطام. لإنشاء رسم بياني لجذر تدرج المجال الساطع يعني مربع صورة الحقل الساطع. انقر فوق الزر التالي.

ثم ضمن علامة التبويب السكان، حدد خيار سلة المهملات لعرض الحاوية المحددة. انقر فوق الصناديق لتحديد مكان الخلايا والتركيز الأفضل. ابدأ وارسم منطقة خط لتحريك الخلايا المركزة.

كلما ارتفع التدرج RMS ، كان التركيز أفضل ، تخطي الخطوة التالية ما لم تكن هناك بقع أخرى للبوابة عليها. يتم إنشاء مخطط مبعثر جديد لشدة القناة الثانية على المحور x مقابل الحد الأقصى للبكسل للقناة الثانية على المحور Y. انقر فوق النقاط واعرض الصور للمساعدة في تحديد المنطقة التي يجب رسمها حول الخلايا الإيجابية للجسيمات النانوية أو البكتيريا.

يتم إنشاء رسم بياني لميزة الاستيعاب بمنطقة تبدأ من الصفر ، والتي يجب تعديلها عن طريق مراقبة الصور. ميزة الاستيعاب هي نسبة الشدة داخل الخلية إلى شدة الخلية بأكملها. يتم تحجيمها بحيث تكون قيمة صفر نصف الشدة في الداخل.

أنشأ المعالج منطقة من كل خلية تحدد الداخل عن طريق صنع قناع يتم استخدامه ، إدخال صورة الخلية للعثور على سطح الخلية وتآكل هذا بمقدار أربعة بكسل. لاحظ أنه يمكن ضبط هذا القناع يدويا لأنواع الخلايا المختلفة عند الضرورة عن طريق إنشاء قناع كائن على صورة الحقل الساطع أولا وتآكل ذلك بوحدات بكسل أكثر أو أقل. يتم حساب ميزة الاستيعاب بناء على قناع الكائن المتآكل هذا باستخدام خوارزمية في البرنامج.

تسمح لنا هذه الميزة بالتمييز بين الجسيمات والبكتيريا الداخلية التي تحتوي على غالبية إشارة الفلورسنت الخاصة بها داخل حدود القناع والجسيمات والبكتيريا المرتبطة بالسطح ، والتي لديها غالبية إشارة الفلورسنت خارج حدود القناع كما هو موضح في هذا المثال ، قم بإنشاء رسم بياني جديد بميزة استيعاب جديدة بناء على قناع الكائن المتآكل. ارسم منطقة للبوابة على الخلايا الداخلية من خلال عرض الصور في وضع السلة المحدد. اضبط البوابة على 0.3.

الخلايا ذات الدرجة الأقل من 0.3 خلايا موجبة للجسيمات المرتبطة بالسطح. للتخلص من الخلايا ذات الملصقات الخلفية وتحديد الجسيمات النانوية أو البكتيريا الداخلية المحددة ، اختر الميزات من قائمة التحليل. انقر فوق قائمة التحليل.

ثم انقر فوق ميزة العد الفوري بجوار لإضافة متوسط العد الفوري إلى تقرير الإحصائيات. في قائمة التقارير ، انقر فوق أيقونة التقارير. ثم حدد تقرير الإحصائيات، ثم أضف أعمدة، ثم حدد على مجموعة الخلايا المناسبة.

انقر فوق موافق. سيقوم معالج الاستيعاب تلقائيا بإضافة إحصائيات إلى هذا التقرير لحفظ ملف البيانات كملف قالب لاستخدامه لتحليل الدفعات لجميع الملفات التجريبية. انقر فوق قائمة الملف وحدد حفظ كقالب.

ملفات القوالب. احصل على نقطة الامتداد AST لتحليل ملفات بيانات متعددة في برنامج الفكرة. انقر فوق الأدوات وحدد ملفات البيانات الدفعية وأدخل جميع ملفات RIF.

أضف ملف مصفوفة التعويض وملف النموذج في الأقسام المقابلة لإرسال الدفعة للمعالجة، انقر فوق إرسال. بعد خطوة المعالجة ، يتم تحليل جميع ملفات RAF ويتم إنشاء ملفات DAF لكل ملف من الملفات الأولية الفردية. يتم إنشاء تقرير نهائي مع إحصائيات لجميع العينات لمقارنة تأثير تثبيط الأكتين ودرجة الحرارة المنخفضة على البلعمة في السالمونيلا والجسيمات النانوية.

تحضين خلايا RA W2 64.7 عند 37 درجة مئوية في الوسط ، إما مع أو بدون سيتو كلاين D أو تحضينها في وسط عند أربع درجات مئوية. قللت كل من درجة الحرارة والتلاعب بالأكتين من استيعاب كل من الجسيمات النانوية والسالمونيلا. ومع ذلك ، فإن احتضان الخلايا في cyto و D يزيد من النسبة المئوية للخلايا ذات الجسيمات النانوية المرتبطة بالسطح مع تقليل النسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على السالمونيلا المرتبطة بالسطح.

تزداد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية للجسيمات النانوية المرتبطة بالسطح من حوالي 8٪ عند 37 درجة مئوية إلى أكثر من 35٪ بعد معالجة cyto و D أو أربع درجات مئوية. في المقابل ، انخفضت النسبة المئوية للخلايا المصابة بالسالمونيلا المرتبطة بالسطح من 35٪ إلى 15٪ بعد معالجة cyto و D ، أدى حضانة خلايا RA W2 64.7 مع السالمونيلا عند أربع درجات مئوية إلى تقليل الاستيعاب دون زيادة واضحة في كمية البكتيريا المرتبطة بالسطح مقارنة بالتحكم 37 درجة مئوية. توضح هذه البيانات معا أن السالمونيلا والجسيمات النانوية يتم استيعابها من خلال عملية خلوية مماثلة تتطلب الأكتين وتعتمد على درجة الحرارة.

علاوة على ذلك ، تشير البيانات إلى أن الارتباط المستمر بالسالمونيلا بالبلاعم يتطلب بلمرة الأكتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استيعاب الخلايا للجسيمات النانوية والبكتيريا عن طريق قياس تدفق التصوير متعدد الأطياف. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن المثبطات سامة للخلايا.

لذلك ، فإن تجارب توصيف السمية الخلوية السابقة ضرورية لتحديد التركيزات المثلى للاستخدام. لا تنس أن العمل مع السالمونيلا يمكن أن يكون احتياطات خطيرة ، مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة وتجنب إنشاء الهباء الجوي يجب مراعاتها عند تنفيذ هذا الإجراء.